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du20131580金虫 (正式写手)
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启动子连接载体 已有2人参与
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最近在做重组实验，将载体原有启动子切掉换成自己要用的启动子序列。长度大约1800bp，用的双酶切，连接转化做了好几次，LB板上有单克隆菌落，但是每次菌p的时候都没有目的条带，菌p引物用的是启动子上游和载体报告基因的下游，预计阳性条带大小为2100bp左右，做了好几次都没有条带，这个可能是什么原因呀，要怎么改进呢？ 发自小木虫Android客户端 |
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-06-19 07:41:29
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用的pBI121载体吗？这个载体好难弄啊，查了查帖子，这个载体的拷贝数超低，怎么也得摇菌40 mL去提质粒，否则质粒浓度太低，做双酶切都不好做，必将还要切胶回收损失很大。准备今天摇它40 mL试试，看看能不能提高质粒浓度为双酶切做准备，不过这得用多少提质粒的试剂啊，怎么也得10次量的。 不知楼主的质粒双酶切浓度如何，如果浓度低，可能就是质粒模板的浓度不够。 |
2楼2018-06-18 22:23:54
du20131580
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送红花一朵 |
谢谢回复～。 载体用的本实验室改造过的pCAMBIA1304，提质粒浓度还可以。载体双切的时候凝胶成像很明显可以看到原载体的启动子被切下来了。连接体系10微升 :6微升双切后的目的片段，2微升的buffer，0.5微升的T4连接酶，2微升的载体。转化DH5α。今天问了问师兄，目的片段和载体重新4＋4试试看看能不能好点。 另外，我的目的片段是加酶切位点引物kod酶PCR后纯化再双切的，没有经过T载过渡，这个会不会导致目的片段末端有问题呀。 发自小木虫Android客户端 |
3楼2018-06-18 22:44:07
海阔天空_812
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4楼2018-06-19 00:01:32
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-06-19 07:41:56
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这个质粒确实不好提 40ml基本够 全部合成一管 最后加上20微升差不多可以达到180左右的浓度 发自小木虫IOS客户端 |
5楼2018-06-19 00:03:04
海阔天空_812
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6楼2018-06-19 00:04:46
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7楼2018-06-19 04:52:33
du20131580
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8楼2018-06-19 04:59:30
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9楼2018-06-19 09:28:39
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请教下，pBI121质粒的双酶切体系和程序？ 我双酶切HindIII和XbalI构建启动子表达载体，用的TaKaRa的快切酶，37℃ 20 min，80℃ 15 min，其实两个酶的失活条件不一致，我就选择了80℃的，失活这步骤应该没问题。 之后跑胶回收，感觉酶切完全了，毕竟之前提的质粒浓度也不大，但是双酶切产物做PCR检测35S（用的M13R引物和GUS基因上设计的一个下游引物，目的带1025bp）依旧有亮带。这样看来，用PCR的方法检测双酶切是否完全，也不一定好吧。或将双酶切产物再双酶切一次？ 转化失败的概率特别高，可能线性化载体的浓度及量需要加大，自己之前做的线性化载体的浓度都比较低，目测40 ng/μL，取3 μL去做连接是否太少了？ |
10楼2018-06-19 09:43:27
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