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[求助]
引物设计添加信号肽，求助大神们！！！
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各位大神，我的老板最近想要在我们设计的引物上添加信号肽，使目的蛋白表达为信号肽（我们蛋白原本为包涵体蛋白）。 我查了一些资料，现在有几个问题，望大神们能帮帮忙~~ 1.有的资料说含有信号肽引物设计时，应当是“保护碱基+ATG+信号肽+ATG+目的序列”，应当是这样吗？两个起始子是否会影响我的目的蛋白的表达？或者可以添加在下游终止子前面？ 2.对于信号肽序列，是根据什么要求在引物中添加呢？是否是信号肽序列就可以？部分资料中的信号肽序列都好长啊~，如果按照这个要求设计引物，势必会对上下游引物的退火温度等相关数据产生影响，而且会影响PCR的结果，是否有相关方法可以避免呢？ |
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不太明白你的意思，做分泌蛋白表达的话是根据你的表达系统的。我们实验室做真核表达体系，一般用哺乳动物的信号肽，如果你用原核生物表达当然就用原核生物的信号肽了。如果你蛋白本身为包涵体蛋白你分泌表达不会影响它正常的结构吗？添加信号肽你用重叠PCR就行，先重叠P出信号肽，然后用酶切酶连的方式放到起始密码子前，真核生物的话，在信号肽后会放一段Kozak序列用来增强表达。至于你说的保护碱基一般用6到8个，反正便宜，我们一般都用8个，这只是用来方便酶切后把信号肽连上载体上的，平末端的话，你只需要一半就行，不用加保护碱基。真核生物信号肽就100多核苷酸吧，不是很多吧分成几段重叠延伸很容易就出来了。 发自小木虫Android客户端 |
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