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海边闲散人

新虫 (小有名气)

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[求助] 为什么双酶切后测序找不到上游酶切位点？已有1人参与

上游起始密码子前5端加入了BamH1的酶切位点，做了菌落PCR后，强阳性，pcr产物测序结果找orf后做blastp，和预期片段比对率98%，目的片段应该是加上去了。但是，一代测序的结果中找不到酶切位点，更没有酶切位点上游的序列，整个序列可以找到atg但感觉不是原来的起始密码子。下游酶切位点及后面序列都没问题。载体用的是pet-32a原核表达载体，下游有酶切位点，后面就是载体序列。
分析可能：酶的特异性不佳，有星活力。还有别的原因吗？求助，谢谢大神们了～～

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