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求大神指导！多谢！关于用巢式PCR来做race的相关问题！已有1人参与
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各位大神你们好！ 我的问题是这样的： 有一段基因NCBI上还没有经过验证， 我想得到一段基因的cds complete，但是根据转录组测序给的cds predict设计引物一直没有p出条带， 于是，我比对了同源基因，在保守区设计了引物，顺利p出中间一段基因。测过序了，有大概1200bp， 接下来，我需要做5’race和3’race， 请教了卖试剂盒的老师， 她说如果设计5’race巢式PCR，那么GSP1与GSP2之间大概间隔100bp,GSP2与模板交联100bp， 3’race同理， 那么问题来了， 我如果分别做出5’race和3’race，我需要把p出的条带分别拿去测序吗？ 然后根据5’race和3’race测序结果继续设计引物，重新p全长吗？ 还是说我设计5’race和3’race引物的时候交叉一下？可是交叉的话那样跟模板交联的就不是100bp而是1200bp左右了啊。  |
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渊博震天
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1 2018-07-31 17:32:44
silicare: 金币+5, BioEPI+1 2018-07-31 17:32:44
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当然是能出现特异性条带的PCR是最好的  ，既然出来了淡淡拿的条带现在有两个方法：1、多P几管，之后过PCR柱式产物纯化试剂盒回收，2、设计特异性引物再进行巢式PCR。我建议你在用降落PCR的同时，多设计几个特异性引物多P几轮进行降落巢式PCR。构建文库我暂时还没做过，所以不做评价。设计引物时软件的评分作为一个参考，当然如果软件评分奇差的话，就建议换换位置设计。“目前我是在靠近两端200bp以内设计的，并且优先考虑跟其他的物种较为同源的序列”这句话的意思是这个特异性引物设计是根据比对出来的？ PCR原装的酶确实效果很好，如果用完了的话可以考虑用“反转录酶 PrimeScript™ II Reverse Transcriptase”或者“反转录酶 PrimeScript™ Reverse Transcriptase”代替 UPM用完了可以参照网上的进行混合，但是要注意配置的时候用的离心管、枪头和水保证RNA Free的 |
6楼2018-07-13 13:27:40
渊博震天
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pcr的兔子: 金币+5, ★★★很有帮助 2018-06-20 19:38:05
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pcr的兔子: 金币+5, ★★★很有帮助 2018-06-20 19:38:05
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GSP引物设计是这样的，首先在你已经p出来测序的中间序列中设计GSP1引物，注意别与接头引物形成稳定二聚体啥的，同时退火温度要高。GSP2设计同GSP1，GSP2是为了防止第一轮非特异性扩增而进行巢式PCR设计的引物，有时候可能需要三轮才出特异条带。当特异性条带出现后TA克隆去测序，出来的序列再与已知中间序列拼接即可知道完整序列。5'相对要难一些，注意RNA完整性一定要高！！！ 发自小木虫Android客户端 |
2楼2018-04-30 15:26:35
3楼2018-07-06 00:41:44
渊博震天
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4楼2018-07-06 08:26:28
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版主你好，在使用宝生物的盒子做RACE的过程中，①怎样的PCR是比较合适的呢？目前我尝试了说明书里的降落PCR和一般的PCR，效果都不是很显著，只有一个引物有微弱的条带，但是不足以将其纯化回收出来。另外，想请问一下，②是否有方法可以检测一下构建的文库的质量呢？我检测了RNA的完整性很好但是我办法保证我构建的文库的质量很好啊。在设计引物的时候，③是否应该过分关注软件的评分呢？比如错配，发卡结构之类的。目前我是在靠近两端200bp以内设计的，并且优先考虑跟其他的物种较为同源的序列，④不知道这个原则是否是最优的选择。关于试剂的问题我有一个问题想问问，构建文库以后，进行的PCR那步原装的酶用完了，我用其他的进行了代替，⑤效果不好不知道这个方案可行吗？或者有什么酶可以推荐代替的，原装的那个酶太贵了。还有就是UPM用完了，⑥我参照网上的 0.4uM 长引物和2uM 短引物的比例进行配比制作，不知道这个配比是否正确，混合过程有什么需要注意的吗？ 问题有点多，还请版主海涵，谢谢版主。 |
5楼2018-07-13 11:47:48
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十分感谢版主的回复。第一点目前还没有试过巢式PCR，谢谢版主的提示我着手试一试。第二点“构建文库”，我可能没有表述清楚，构建文库就是做RACE之前的那个反转录，如果反转录都不做怎么开始做末端扩增呢？第三点引物设计那块，基础序列是来自于转录组数据，不是全场，然后在做了普通PCR从两头往中间扩增，得到准确序列之后，blast结果出来，跟相近的序列比对，发现，有同源性非常高的部分，然后设计引物的位置是在3'和5'两端200bp以内的位置设计的（目前的参考片段有800+）。第四点，感谢版主推荐的酶，感谢版主回答我的问题，谢谢！ 发自小木虫Android客户端 |
7楼2018-07-13 23:54:34