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yuntaishan2008

金虫 (正式写手)

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[求助] 求助！！！精子RNA提取！！！！已有2人参与

我最近提精子RNA浓度可以但 A260/A280比值一直上不去，一般在1.5-1.65之间，这是什么问题，求各位大师指导?操作步骤如下：

1、将冷冻精子从液氮罐中迅速取出后，在37 °C水浴锅上30S内解冻到1.5mL无RNA酶的离心管中（样品量160ul），4°C条件下1000 r/min离心3 min,弃上清。2、用DEPC处理过的预冷到4°C的PBS缓冲液洗涤沉淀两次，1000 rpm/min离心3min,弃上清。
3、向沉淀中加入1ml的Trizol，祸旋震荡，在室温下静置5 min。
4、向离心管中加入20 uL β-硫基乙醇,混勻，65°C，水浴30 min,取出后冰浴1 min.。
5、向离心管中加入0.2 mL的氯仿，手动用力震荡15s，室温孵育10min，12000 rpm 4 °C离心15min。
6、离心后溶液分为三层，小心吸取上层水相至新的无RNA酶的离心管中。
7、二次氯仿抽提蛋白
8、向离心管中加入等体积的异丙醇，轻轻反复颠倒混勻，室温静置lOmin, 12000 rpm离心10 min。
9、离心后试管底部会出现沉淀，此为提取出来的RNA。小心弃去上清，缓慢的沿离心管壁加入DEPC水配制的75%的乙醇1 mL，切勿触及沉淀，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000 rpm 4 °C离心5 min后小心弃去乙醇。
10、室温干燥燥沉淀2-3 min，使乙醇完全挥发，用30ulDEPC处理的水溶解沉淀后，于-80 °C保存备用。

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1楼2018-04-27 17:35:23

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linhaobua

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yuntaishan2008

2楼2018-04-27 22:57:45

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yuntaishan2008

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引用回帖:

2楼: Originally posted by linhaobua at 2018-04-27 22:57:45
首先A260/A280只是一种指标，不能那么苛求。
A280是蛋白的吸收波长，说明蛋白在抽提的过程中没有抽提干净，在吸取氯仿离心后的上清时要注意，可以少吸取。
最后，干燥沉淀的时间还是有些短，可以适当的延长时间
...

谢谢您的热情帮助，我按照您的建议试试啊！如有问题，还望您多多赐教啊！