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yuntaishan2008金虫 (正式写手)
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[求助]
求助！！！精子RNA提取！！！！ 已有2人参与
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我最近提精子RNA浓度可以但 A260/A280比值一直上不去，一般在1.5-1.65之间，这是什么问题，求各位大师指导?操作步骤如下： 1、将冷冻精子从液氮罐中迅速取出后，在37 °C水浴锅上30S内解冻到1.5mL无RNA酶的离心管中（样品量160ul），4°C条件下1000 r/min离心3 min,弃上清。2、用DEPC处理过的预冷到4°C的PBS缓冲液洗涤沉淀两次，1000 rpm/min离心3min,弃上清。 3、向沉淀中加入1ml的Trizol，祸旋震荡，在室温下静置5 min。 4、向离心管中加入20 uL β-硫基乙醇,混勻，65°C，水浴30 min,取出后冰浴1 min.。 5、向离心管中加入0.2 mL的氯仿，手动用力震荡15s，室温孵育10min，12000 rpm 4 °C离心15min。 6、离心后溶液分为三层，小心吸取上层水相至新的无RNA酶的离心管中。 7、二次氯仿抽提蛋白 8、向离心管中加入等体积的异丙醇，轻轻反复颠倒混勻，室温静置lOmin, 12000 rpm离心10 min。 9、离心后试管底部会出现沉淀，此为提取出来的RNA。小心弃去上清，缓慢的沿离心管壁加入DEPC水配制的75%的乙醇1 mL，切勿触及沉淀，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000 rpm 4 °C离心5 min后小心弃去乙醇。 10、室温干燥燥沉淀2-3 min，使乙醇完全挥发，用30ulDEPC处理的水溶解沉淀后，于-80 °C保存备用。 |
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