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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 TA克隆
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

[交流] 求助 TA克隆

大家好 小弟最近在做TA克隆，用的TRANS peasy T载体 载体与片段比例为1：2，25度连接15分钟 可是第二天什么都没长。蓝斑和白斑都没有  大家有没有谁有也遇到过这种情况，给小弟支一下招吧   万分感谢
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1楼 2009-03-20 09:44:35
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
说不清道不明啊，重做吧，影响因素太多了，比如模板盐浓度影响，还有酶连的时间长点吧，酶不要加的太多，因为其中有甘油
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帮助虫友，提升自己
2楼2009-03-20 09:52:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
你先看下感受态有没有问题吧
转个空质粒进去先
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3楼2009-03-20 10:30:43
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
刚做的感受态 验证过了 完全没问题
会不会载体有问题啊？
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4楼2009-03-20 10:47:45
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xujiemeng

铜虫 (小有名气)
首先你做转化的时候有必要转个质粒作为对照，其次个人认为你连接时间太短了，我用的是TAKARA的PMD20-T载体一般16度是过夜连接，没有蓝白斑经常会遇到，但是对挑选阳性克隆影响不是很大。
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5楼2009-03-20 10:50:45
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
我用的那个T载体说明书上说25度连接10分钟就可以了。如果片段有问题的话，应该也会长一些蓝斑，但现在什么都不长。
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6楼2009-03-20 10:54:48
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xujiemeng

铜虫 (小有名气)
我用的盒子上面也是叫16度30分钟，可是基本连不上，你的盒子是新的吗？里面的连接BUFFER会不会有问题，注意片段和载体的比列，我前段时间做TA克隆也老是搞不定，这两天刚弄好，是连接buffer的问题。实在不行，你可以换别人的T载体做一个试试。祝你成功！
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7楼2009-03-20 10:59:03
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
谢谢你  那个没盒子就只有载体 连接时什么也不加，就加载体和片段，说明书上这么说的。我打电话问过他们客服，他们也这么说。
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8楼2009-03-20 11:04:54
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jiwu20

铜虫 (小有名气)
载体与片段比例(摩尔浓度)为1：5~10，25度连接3h,try it

[ Last edited by jiwu20 on 2009-3-20 at 11:24 ]
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9楼2009-03-20 11:23:27
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
好的  谢谢 请问你也用过这个载体吗？可以给我介绍一下经验吗？
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10楼2009-03-20 11:24:39
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