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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)

[求助] 引物太长,扩不出来咋回事已有1人参与

万能的虫友,请教下这是咋回事。我在用red系统敲一个基因,用的pkd3载体,引物70bp,一直p不出来,要怎么改进呀。现在已经做过的尝试有,退火温度50~60,引物浓度0.1微摩,1微摩,10微摩,模板20ng,都试了,还是p不出来

@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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梦想是注定孤独的旅程
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wxm0212

新虫 (正式写手)

这么长的引物怎么退火温度这么低

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2楼2018-04-11 17:45:54
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学生孔

新虫 (小有名气)

在引物Tm值上下波动调退火温度

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6楼2018-04-11 19:03:12
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aishida

禁虫 (职业作家)

本帖内容被屏蔽

3楼2018-04-11 17:58:54
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diaomou

新虫 (小有名气)

我也是,做点突变反向pcr,理论9.6k,一直产物电泳弥散

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4楼2018-04-11 18:49:29
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
检查一下有没有比较可能形成引物二聚体。
为什么
5楼2018-04-11 18:57:51
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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wxm0212 at 2018-04-11 17:45:54
这么长的引物怎么退火温度这么低

温度太高和延伸温度太接近可以吗

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梦想是注定孤独的旅程
7楼2018-04-15 12:36:05
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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 学生孔 at 2018-04-11 19:03:12
在引物Tm值上下波动调退火温度

tm值是指参与扩增部分还是总的引物部分,参与扩增的部分只有25 bp,外源片段比较长

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梦想是注定孤独的旅程
8楼2018-04-15 12:37:20
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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2018-04-11 18:57:51
检查一下有没有比较可能形成引物二聚体。

跑出来的全是引物二聚体

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梦想是注定孤独的旅程
9楼2018-04-15 12:38:33
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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by aishida at 2018-04-11 17:58:54
退火温度太低了,合成引物时有个关于引物Tm值的信息,你以他给的为中心试试几个温度梯度

那个给的温度太高,60多度

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梦想是注定孤独的旅程
10楼2018-04-15 12:39:19
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