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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物太长，扩不出来咋回事
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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)

[求助] 引物太长，扩不出来咋回事 已有1人参与

万能的虫友，请教下这是咋回事。我在用red系统敲一个基因，用的pkd3载体，引物70bp，一直p不出来，要怎么改进呀。现在已经做过的尝试有，退火温度50～60，引物浓度0.1微摩，1微摩，10微摩，模板20ng，都试了，还是p不出来

@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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梦想是注定孤独的旅程
1楼 2018-04-11 16:58:59
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wxm0212

新虫 (正式写手)
这么长的引物怎么退火温度这么低

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2楼2018-04-11 17:45:54
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学生孔

新虫 (小有名气)
在引物Tm值上下波动调退火温度

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6楼2018-04-11 19:03:12
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普通回帖

aishida

禁虫 (职业作家)
本帖内容被屏蔽
3楼2018-04-11 17:58:54
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diaomou

新虫 (小有名气)
我也是，做点突变反向pcr，理论9.6k，一直产物电泳弥散

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4楼2018-04-11 18:49:29
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
检查一下有没有比较可能形成引物二聚体。
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为什么
5楼2018-04-11 18:57:51
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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wxm0212 at 2018-04-11 17:45:54
这么长的引物怎么退火温度这么低

温度太高和延伸温度太接近可以吗

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梦想是注定孤独的旅程
7楼2018-04-15 12:36:05
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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 学生孔 at 2018-04-11 19:03:12
在引物Tm值上下波动调退火温度

tm值是指参与扩增部分还是总的引物部分，参与扩增的部分只有25 bp，外源片段比较长

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梦想是注定孤独的旅程
8楼2018-04-15 12:37:20
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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2018-04-11 18:57:51
检查一下有没有比较可能形成引物二聚体。

跑出来的全是引物二聚体

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梦想是注定孤独的旅程
9楼2018-04-15 12:38:33
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Lynsey5166

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by aishida at 2018-04-11 17:58:54
退火温度太低了，合成引物时有个关于引物Tm值的信息，你以他给的为中心试试几个温度梯度

那个给的温度太高，60多度

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梦想是注定孤独的旅程
10楼2018-04-15 12:39:19
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