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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 芽孢杆菌基因敲除问题
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yuevis

铜虫 (小有名气)

[求助] 芽孢杆菌基因敲除问题 已有1人参与

请问，我构建了芽孢杆菌的敲除质粒，同源臂加目的基因的质粒，之后转化进行敲除，对于后面转化敲除不明白希望能得到解答。敲除需要重组酶吗，我把质粒转化进入芽孢杆菌，涂板过夜，挑菌验证就行了吗，这样就能发生重组了吗？文献里只是写转化质粒就行了，为什么转化完就能自动发生重组？重组时间有规定吗，过夜培养就行了？实在是不懂，求解答
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1楼 2018-04-09 11:36:49
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yuevis

铜虫 (小有名气)
有人来解答吗

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2楼2018-04-09 17:35:04
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young1983

木虫 (正式写手)
如果转化效率高是可以发生重组的，只是效率较低。

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3楼2018-04-10 13:32:15
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yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by young1983 at 2018-04-10 13:32:15
如果转化效率高是可以发生重组的，只是效率较低。

怎么提高效率呢

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4楼2018-04-10 15:53:38
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
渊博震天: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-07-28 16:49:05
根据描述看，是利用宿主进行同源重组，同源重组的效率跟同源臂长度结构和宿主同源重组相关的蛋白有关系。同源重组的效率一般不是很高，需要借助抗性等选择标记进行筛选。
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为什么
5楼2018-04-23 20:39:36
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yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2018-04-23 20:39:36
根据描述看，是利用宿主进行同源重组，同源重组的效率跟同源臂长度结构和宿主同源重组相关的蛋白有关系。同源重组的效率一般不是很高，需要借助抗性等选择标记进行筛选。

如果我的不是敲质粒，不用抗性基因敲除，只是想把基因（具有功能的）交换一下，验证共能与产物，那么怎么筛选呢?

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6楼2018-04-23 22:37:19
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by yuevis at 2018-04-23 22:37:19
如果我的不是敲质粒，不用抗性基因敲除，只是想把基因（具有功能的）交换一下，验证共能与产物，那么怎么筛选呢?
...

很难，除非针对目的基因功能缺失有相应的筛选方法。
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为什么
7楼2018-04-23 23:41:16
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yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 547star at 2018-04-23 23:41:16
很难，除非针对目的基因功能缺失有相应的筛选方法。...

芽孢杆菌自身重组酶效率高吗

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8楼2018-04-24 00:19:28
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547star

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yuevis at 2018-04-24 00:19:28
芽孢杆菌自身重组酶效率高吗
...

不算太高。做整合或敲除，转化效率也是一个重要影响因素，如果没有筛选标记，连转化和没有转化都区分不开的话，很难做。
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为什么
9楼2018-04-24 11:19:59
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xmcsxq0606

新虫 (正式写手)
用敲除的基因一对引物来验证，p不出则为阳性

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10楼2018-07-28 08:37:19
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