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细菌RNA提取要注意什么啊？
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请问大家有没有提取细菌RNA的经验啊 怎么老是降解呢？ 操作中应该注意什么 我使用的方法提取组织的RNA都是可以的 但是细菌的降解很厉害 请高手指教 [ Last edited by 350784478 on 2009-10-10 at 13:33 ] |
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wahaha8127(金币+1,VIP+0):谢谢！ 3-16 10:39
wahaha8127(金币+1,VIP+0):谢谢！ 3-16 10:39
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细菌的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多（占80%~85％），RNA的分离提取中最关键的因素是尽量减少纯化过程中内源核外源性RNA酶对RNA的降解。所以实验过程中要有效去除RNA提取中的DNA和蛋白质。采用高活性RNA酶抑制剂可以防止RNA降解，采用酚、氯仿抽提可以方便地去除RNA提取物中的蛋白质。实验中所用到的TRIzol是一种酚和RNA酶抑制剂的混合物，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性。实验试剂及用品用0.1%DEPC水处理，实验过程中也需注意尽量避免RNA酶污染。 RNA的提取： 1.2ml过夜培养的细菌LB培养液 10000r/min，离心1min，收集菌体 向EP管中加入1mlTRIzol试剂，用枪头反复吹打裂解细胞，室温放置5min 向EP管中加入0.2ml氯仿，用力摇晃30秒钟，冰浴10 min 10000r/min，4oC离心15min 小心吸取上层无色水样层转移至一新EP管中 加入0.5ml异丙醇，室温放置10min或-20o放置几个小时 10000r/min，4oC离心10min，轻轻倒去上清 加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，用枪头吹打均匀，8000r/min，4oC离心5min 弃上清，空气干燥，加入20ul无RNA酶的DEPC水 取溶解后RNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
2楼2009-03-16 09:41:04
3楼2009-03-16 10:41:50
