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juliusluan78

木虫 (著名写手)

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专业: 高分子合成化学

[交流] 求助：CTAB法提取真菌标本DNA

我用CTAB法提取担子菌子实体标本DNA，采用的是以下实验步骤：
（1）取材：取2~4 mg干净的菌块干标本或碎片在1.5 ml于微量离心管中，将该离心管及无菌的研钵、微型研柞于-20℃冰箱预冷。
（2）液氮研磨：将液氮倒入预冷的研钵中，该预冷的微量离心管置于其中，用微型研柞直接在微量离心管中将干标本研磨成细粉。
（3）CTAB提取：在微量离心管中加入65 ℃水浴保温的2%( w/v)CTAB抽提缓冲液700 µl在旋涡混合器上震荡数秒，使之充分混合均匀后，于65 ℃水浴温育0.5-2小时。
（4）酚：氯仿：异戊醇抽提：冷却至室温后，加入与之等体积的饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1) ,颠倒混匀10分钟；13000 rpm离心15分钟，用200 µ1移液器将上清液转入新的离心管中，弃沉淀。
（5）氯仿：异戊醇抽提：上清液中加入与之等体积的氯仿:异戊醇(24: 1)，颠倒混匀10分钟；13000 rpm离心15分钟，用200 µ1的微量移液器将含有DNA的上层(水相)小心地移入一只新管中，如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则重新抽提有机相1-2次，合并水相。将最终的上清液用 200 µ1的微量移液器小心转入一只新离心管中。
（6）乙酸钠调节：往上清液(DNA溶液)中加入1/10体积的3 mol/L pH5.2的乙酸钠，用手指轻弹离心管壁几次使之混匀。
（7）异丙醇沉淀：加入与DNA溶液(含盐溶液)等体积的异丙醇（-4 ℃预冷）轻轻混匀，于-4℃静置过夜。
（8）75%乙醇洗涤：13000 rpm离心15分钟，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀物两次。
（9）干燥：室温下自然晾干。
（10）DNA的重悬：自然干燥后加入20 µ1无菌的超纯水重悬。
（11）取2~5 µl DNA于1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度。
采用以上方法提取物检测照片见附件（最亮的那一团的条带，箭头标注）
后面我又采用将装有菌块的离心管置于液氮（5min），取出用微研杵研磨，反复3次，再按照以上方法提取，结果离心后发现什么也没有，甚至连对照新鲜的菌丝也没有提出来
那位楼主能救救急，万分感激！

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