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[交流]
免疫组化中如何防止脱片
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听到很多人抱怨，在免疫组化实际操作中遭遇过组织易脱片的问题，今天我将结合一些个人经验，与大家分享简单易操作的解决方法。 方法一： 使用防脱玻片，组织当然是越新越好。 方法二： 某些免疫组化染色时候，需要涉及多种抗原修复方法，如某实验需要双修复（热修复和酶修复），热修复相对来说是比较剧烈的（如放在 EDTA 中煮 1 min），沸腾的液体对组织还是有很大的冲击力的，此时组织容易脱，如果热修复放在酶修复后，则组织更容易脱，相反如果将不剧烈的酶修复放在热修复后，可以减少脱片的发生。 但很多时候知道这些似乎解决不了问题，不少研友们由于读研时间仅仅 3 年，重新收集新鲜标本显然不可能，回顾性研究中，某些病例比较罕见，活检取出组织也相对宝贵，且由于当时条件限制等多种原因造成如下问题： 空白片少，经不起反复折腾； 回顾性研究中不可能使用新鲜的切片组织； 某些单位先前并没有使用防脱载玻片保留组织标本等。 这些给实验科研造成一些困境，以下是本人改良后的方法与心得（以无防脱的非新鲜组织为例，修复方式为热修复和酶修复），脱蜡、水化及后续染色等处理均按原先各自的实验流程处理，这里仅介绍如何防脱。 如上所说，先采用酶修复，后热修复，一般热修复是直接置于相应的修复液中煮沸，期间还有可能使用高压锅。 1. 酶修复 各自抗原特性选择，有些时候酶修复的时间是极其难把握的。时间太长，消化过头容易脱片；时间太短，抗原暴露不充分，这些都影响实验结果。 建议：稀释浓度，延长时间。 缺点：不能使用说明书推荐时间，需要自己摸索几次。 2. 热修复 本人尝试如下改良（理论基础：抗原修复时仅需要组织与修复液接触，且只要薄薄的一层就能反应）。 改良一： 敞开高压锅盖，置一铁架于修复液面，其上放置玻片，玻片上滴加修复液体（铁架高度以沸腾修复液不会触及玻片为妥）。为了防止玻片上的修复液挥发，可在滴加修复液后盖上盖玻片，提供热源使修复液保持沸腾状态，使用热蒸汽加热。 优点：避免了组织在液体中的剧烈沸腾，减少脱片。 缺点：降低了抗原修复的温度，可能导致某些抗原无法达到其修复所需温度，使用此法可能需要适当延长热修复时间。 改良二： 修复液煮沸后，滴加于载玻片上，覆盖盖玻片，用实验室常见的封口膜将玻片和盖玻片包绕（包绕的目的不是为了隔绝空气，而是防止盖玻片移动导致修复液在组织表面挥发，封口膜受热后收缩，即可固定）。将包绕好的玻片置入铁架上，按原先操作继续（可放入高压锅中）。 优点：避免了改良 1 中可能无法达到所需修复温度的问题，可以放入高压锅中。 缺点：所有片子变成平铺展开，一次所能做的片子数目减少。 注意事项： 使用盖玻片后，尤其是使用封口膜后，揭片的过程一定要轻柔，用镊子，避免徒手操作，如遇到揭片困难，可适当用 PBS 冲洗，不可暴力揭片，否则适得其反； 由于每个实验室条件不同，还应根据自己所在实验室条件调整； 免疫组化步骤繁琐，影响因素较多，出现问题要仔细思考。以上两个方法本人亲测可有效解决脱片问题，希望能帮助到大家。 |
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