| 查看: 4623 | 回复: 12 | |||
[交流]
引物设计不合理，PCR无结果，你中招了吗？已有10人参与
|
|||
|
导读 细胞之邦，互助你我。感谢大家的关注，我是小邦。今天我们分享的是PCR实验中引物设计的问题。 设计PCR用引物时的注意事项? 可以从以下几个方面考虑： 1. 引物长度通常为20～25 mer。但进行LA PCR时，引物长度应增长为30～35 mer。 2. 二条引物之间不能进行Annealing，对3′端的3个碱基需特别注意 3. GC含量在50～60%，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，3′端应避开AT rich结构 4. 避开引物自身形成二级结构 5. 选择Tm温度相互接近的二条引物 PCR用引物的Tm值的计算方法? 引物为20 mer以下时： Tm = 2℃×(A+T) + 4℃×(G+C) 引物为20 mer以上时： Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L ， 其中L为引物的长度。 在PCR反应过程中选择Annealing温度时，一般为 (Tm - 5)℃。 PCR用引物的使用量? 合适的终浓度可在0.1 μM～1.0 μM之间选择。引物的浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA (例如Human genome DNA) 作模板时，引物浓度应低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA (例如Plasmid等)作模板时，引物浓度应高一些。 简并性引物对PCR扩增有无影响? 有影响。简并数量应尽量少。通常一条引物中简并的碱基不要超过4处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物的量相对减少，此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。 |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有221人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
4楼2018-02-08 16:43:01
kshdd
金虫 (著名写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 2819.8
- 散金: 763
- 红花: 12
- 沙发: 2
- 帖子: 1795
- 在线: 432.2小时
- 虫号: 3384976
- 注册: 2014-08-27
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
3楼2018-02-08 15:47:55
qewhuinqi
新虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 3073.7
- 散金: 10
- 红花: 2
- 帖子: 753
- 在线: 77.5小时
- 虫号: 5002177
- 注册: 2016-09-11
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
赞同，不管是上课还是听报告什么的，总告诉我们设计的原则，可是实际上原则和我们有毛线关系啊，都是软件设计的，都不是我们自己一个个碱基拍进去。这些原则应该讲给设计软件的人听，我们了解就可以了 发自小木虫Android客户端 |
6楼2018-04-09 23:42:45
happymxh
铁虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1101.9
- 散金: 151
- 红花: 2
- 帖子: 357
- 在线: 42.1小时
- 虫号: 3001830
- 注册: 2014-02-27
- 专业: 食品加工技术
2楼2018-02-06 16:01:32
happymxh
铁虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1101.9
- 散金: 151
- 红花: 2
- 帖子: 357
- 在线: 42.1小时
- 虫号: 3001830
- 注册: 2014-02-27
- 专业: 食品加工技术
5楼2018-02-09 06:07:01
7楼2018-04-11 09:57:51
8楼2018-05-09 16:54:18
1902194422
铁杆木虫 (小有名气)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 6495.8
- 红花: 2
- 帖子: 291
- 在线: 105.8小时
- 虫号: 2670870
- 注册: 2013-09-22
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
9楼2018-05-29 11:01:09
10楼2018-06-29 21:04:48