应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物设计不合理，PCR无结果，你中招了吗？
131/2返回列表12下一页
查看: 4814  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

myhalic

铜虫 (小有名气)

[交流] 引物设计不合理，PCR无结果，你中招了吗？ 已有10人参与

导读
细胞之邦，互助你我。感谢大家的关注，我是小邦。今天我们分享的是PCR实验中引物设计的问题。
设计PCR用引物时的注意事项?
可以从以下几个方面考虑：
1. 引物长度通常为20～25 mer。但进行LA PCR时，引物长度应增长为30～35 mer。
2. 二条引物之间不能进行Annealing，对3′端的3个碱基需特别注意
3. GC含量在50～60%，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，3′端应避开AT rich结构
4. 避开引物自身形成二级结构
5. 选择Tm温度相互接近的二条引物
PCR用引物的Tm值的计算方法?
引物为20 mer以下时： Tm = 2℃×(A+T) + 4℃×(G+C)
引物为20 mer以上时：   Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L ， 其中L为引物的长度。
在PCR反应过程中选择Annealing温度时，一般为 (Tm - 5)℃。
PCR用引物的使用量?
合适的终浓度可在0.1 μM～1.0 μM之间选择。引物的浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA (例如Human genome DNA) 作模板时，引物浓度应低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA (例如Plasmid等)作模板时，引物浓度应高一些。
简并性引物对PCR扩增有无影响?
有影响。简并数量应尽量少。通常一条引物中简并的碱基不要超过4处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物的量相对减少，此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2018-02-06 15:56:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

myhalic

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by happymxh at 2018-02-06 16:01:32
怎么设计吧，我是小白

http://www.hlkbio.cn/news/110-cn.html 这里有关于如何用在线软件设计引物的方法，你可以看看
赞一下(3人) 回复此楼
4楼2018-02-08 16:43:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kshdd

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by happymxh at 2018-02-06 16:01:32
怎么设计吧，我是小白

引物设计一般都用软件进行的，而且自己做的一般是针对单菌；若是环境样品的话，只能试文献中的各种引物，不建议自己设计。我觉得引物设计原则可以拿过来作为软件设计的标准对照
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2018-02-08 15:47:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qewhuinqi

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by kshdd at 2018-02-08 15:47:55
引物设计一般都用软件进行的，而且自己做的一般是针对单菌；若是环境样品的话，只能试文献中的各种引物，不建议自己设计。我觉得引物设计原则可以拿过来作为软件设计的标准对照...

赞同，不管是上课还是听报告什么的，总告诉我们设计的原则，可是实际上原则和我们有毛线关系啊，都是软件设计的，都不是我们自己一个个碱基拍进去。这些原则应该讲给设计软件的人听，我们了解就可以了

发自小木虫Android客户端
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2018-04-09 23:42:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happymxh

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
怎么设计吧，我是小白

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2018-02-06 16:01:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

happymxh

铁虫 (正式写手)
收到，谢谢！

发自小木虫Android客户端
回复此楼
5楼2018-02-09 06:07:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

沈彦祖128

铁虫 (初入文坛)
mark
回复此楼
7楼2018-04-11 09:57:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南风小酣

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by qewhuinqi at 2018-04-09 23:42:45
赞同，不管是上课还是听报告什么的，总告诉我们设计的原则，可是实际上原则和我们有毛线关系啊，都是软件设计的，都不是我们自己一个个碱基拍进去。这些原则应该讲给设计软件的人听，我们了解就可以了
...

设计原则也可以让我们对软件设计出来的引物进行筛选啊
赞一下 回复此楼
8楼2018-05-09 16:54:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1902194422

铁杆木虫 (小有名气)
好贴~~
回复此楼
有些梦，虽然遥不可及，但并不是不可实现.....
9楼2018-05-29 11:01:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

KM石头

金虫 (正式写手)
好贴
回复此楼
10楼2018-06-29 21:04:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 myhalic 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 341求调剂(一志愿湖南大学070300) +5 番茄头--- 2026-03-22 6/300 2026-03-23 23:45 by Txy@872106
[考研] 材料292调剂 +4 橘颂思美人 2026-03-23 4/200 2026-03-23 23:16 by peike
[考研] 335分 | 材料与化工专硕 | GPA 4.07 | 有科研经历 +4 cccchenso 2026-03-23 4/200 2026-03-23 23:00 by 徐ckkk
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +5 niko- 2026-03-22 5/250 2026-03-23 22:01 by fuyu_
[考研] 化学308分求调剂 +3 你好明天你好 2026-03-23 3/150 2026-03-23 20:11 by macy2011
[考研] 350求调剂 +6 weudhdk 2026-03-19 6/300 2026-03-23 15:47 by tangyuan0840221
[考研] 323求调剂 +6 洼小桶 2026-03-18 6/300 2026-03-23 00:29 by king123！
[考研] 311求调剂 +6 冬十三 2026-03-18 6/300 2026-03-22 20:18 by edmund7
[考研] 一志愿北京化工大学070300 学硕336求调剂 +5 vv迷 2026-03-21 8/400 2026-03-22 14:20 by ColorlessPI
[考研] 一志愿东华大学控制学硕320求调剂 +3 Grand777 2026-03-21 3/150 2026-03-21 19:23 by 简之-
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-20 7/350 2026-03-21 19:05 by 15709483992
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境总分308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-20 7/350 2026-03-21 16:36 by barlinike
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 求调剂 +6 Mqqqqqq 2026-03-19 6/300 2026-03-21 08:04 by JourneyLucky
[考研] 初始318分求调剂（有工作经验） +3 1911236844 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:33 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-03-18 6/300 2026-03-21 00:32 by JourneyLucky
[考研] 一志愿中海洋材料工程专硕330分求调剂 +8 小材化本科 2026-03-18 8/400 2026-03-20 23:16 by JourneyLucky
[考研] 招收调剂硕士 +4 lidianxing 2026-03-19 12/600 2026-03-20 12:25 by lidianxing
[考研] 0703化学调剂 +4 18889395102 2026-03-18 4/200 2026-03-19 16:13 by 30660438
[考研] 【同济软件】软件（085405）考研求调剂 +3 2026eternal 2026-03-18 3/150 2026-03-18 19:09 by 搏击518
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭