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红木深衣捐助贵宾 (小有名气)
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有关western blot的问题 已有2人参与
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1，选择一抗的问题。一抗是根据我要测的目标蛋白的种属来源来选择吗？假如我是人的细胞，转染了小鼠的某个基因，要检测这个基因是否表达，那我选择的一抗就是抗鼠源的抗体吗？一抗的特异性是指种属的特异性吗？假如我选择了抗鼠源的一抗，那所有的小鼠体内产生的蛋白质都能与这个一抗结合吗？我换个说法，假如是一个正常的小鼠肝癌细胞，处理后用western blot方法测蛋白质，选择抗人源的一抗，因为人的细胞里会有各种蛋白质，那最后测到的蛋白质岂不是有各种。 2，关于内参。还是上面的例子，假如我是人的肝癌细胞，转染的小鼠的基因，要测这个小鼠基因是否表达蛋白质。假如选择actin做内参，是选择人的actin吗，还是鼠的actin。假设答案是人的actin，是不是我除了要加目标蛋白的一抗二抗，在加一抗的时候我还要再额外加抗人源的一抗，然后二抗也要再额外加抗内参一抗的二抗。也就是一抗二抗都要加两种？ |
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ken19860823
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【答案】应助回帖
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1.有点乱，抗体抗抗原跟来源无关，是特定抗体能特异性识别蛋白的表位。你做western,在人细胞表达老鼠基因，是检测这个蛋白表达情况。第一步确定这个蛋白已经有抗体了，我们买一抗会标注来源是因为不同种属的类似功能蛋白序列是不一样的，这样表位也可能不一样（当然有一样的），如果这个表位是人鼠公用的，那么这个抗体信息会标注反应物种包括人和鼠。另外你搞混了一抗和二抗的概念，所有某一物种来源的抗体，包括FAB（可变，结合抗原）和FC（不可变，物种特异）段，二抗是其他物种抗FC段的抗体。所以，没有人的一抗这种说法，因为没人会用人来作为宿主来生产抗体，一抗来源一般是（mouse,rat,rabbit,goat,donkey）,通过这些物种产的一抗都带特定的FC段，用FC段在另外一种属产生二抗，这样这个抗体可以抗所有这一宿主产生的一抗。这样的设定是为了什么呢，举个栗子，westernblot是利用一抗来特异性标记目标，然后二抗带标记来特异性识别一抗，这样就可以通过二抗的标记（HRP）特异性与化学发光小分子反应来体现目标多寡。为什么要用二抗，直接一抗标记个HRP不就可以了，折腾什么？？但是如果有二抗了，不同目标的一抗，只要是鼠的，都可以用同一二抗，这样是不是很简单（因为二抗是抗FC，一抗只要种属一样，FC是一样的）。市场上是可以买到一抗就标记了荧光分子或者HRP之类的，所以买一抗看清楚，是conjugated还是unconjugated。相信你懂了，比你更乱。 2.关于内参，只是用来反映你的目标蛋白实际的表达量，举个栗子。你在人的细胞表达老鼠基因，人的细胞里面有些housekeeping基因表达量差不多是一定的如βactin,这样你买一个抗βactin的抗体一个抗老鼠基因的抗体，做westernblot不就可以看出老鼠基因相对于已知蛋白的量了吗。具体来说如果我买，一抗无所谓种属，只看特异性，我只看抗人的βactin的这些抗体里面哪个是最好用的（看文章结论），比如mouse来源的，那就买抗mouse-anti-βactin这个抗体。二抗才只看一抗来源，所有mouse的二抗是一样的（至少目前遇到的都是，除非备注），二抗数量是有限的，具体到标记物其实每个公司都差不多，我们公司用的life的，抗mouse的二抗，就买anti-mouse(公司表达，其实是抗mouse FC段）HRP conjugated. 搞免疫的可能经常听到人源化抗体，其实不是来源人的抗体。仔细想想为什么，稍微看下书看看抗体是怎么制备的。 |
2楼2018-01-19 11:58:30
chaosyw
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【答案】应助回帖
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楼上正解，关于抗体购买时的选择问题，推荐一个平台供参考： http://www.dxy.cn/bbs/topic/38062650 在推荐一篇wb内参选择方面的综述： https://www.labome.com/method/Lo ... -Western-Blots.html |
3楼2018-01-20 09:17:18
