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求助制备感受态细胞DH5a
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我用TSS法制备感受态细胞DH5a，制备了几次都不好用。阳性质粒转化都没有长出菌落来。 请教，问题会出在哪里呢？我制备的方法如下，请大家帮忙看一下。多谢 1.取感受态种子接种于含有LB的2ml试管中，37度振荡培养 2.将上述培养液用LB按1：100稀释后，37度振荡约3h（OD为0.5±0.03） 3.把培养物放在冰上冷却后，2500rpm 4度离心10min，收集菌体，弃上清 4.使用前准备好1X TSS(10% W/V PEG 3350, 50mM MgCl2, 85%LB) 5.将收集到的菌体重悬于1X TSS（每100ml 培养物溶解于10ml 的1X TSS）, 混 匀。注意保持冰上操作 6.用1.5ml EP管冰上分装，200μL/管，后放于-70保存 |
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我自己的方法 转化效率还比较高 大肠杆菌感受态细胞的制备 从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落（超净工作台操作），接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：100～1：50(500ul:50ml)转接于20ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养； 取培养液1.5ml转入微量离心管中，在冰上冷却10min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）。 倒净上清培养液，用500µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴，0～4℃，4000r／min离心10min； 弃去上清液，加入200µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。 冰上放置30min； 0～4℃，4000r／min离心10min； 弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液（立即用于转化实验）或者加入100µl冰冷的含15%甘油的0.1mo1／L CaCl2溶液（超低温－80℃冷冻贮存备用）。 还有一点就是，我第一次感受态效率也很低，其实你可以试试多富集一点细胞，或者重新划平板活化菌种，效果更好。 |
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