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LMN2012

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白洗涤过程中出现蛋白变性的问题 已有3人参与

最近,利用大肠杆菌系统表达了一个50多KDa的蛋白,通过对超声后的上清和沉淀分别进行电泳发现,目标蛋白绝大多数都在沉淀中,怀疑是包涵体形式表达,可是利用实验室常用的包涵体清洗液ph9.5(氯化钠,edta,tris,triton x-100,尿素)对沉淀进行洗涤离心后,溶液中大部分沉淀结成硬块,极少部分可以溶解,有少量蛋白存在,这样看是蛋白在洗涤过程中变性了,可是变性的原因不清楚,请大神提点下。

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xiaoxiao1993

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

大肠杆菌被研究的很透彻,但是大肠杆菌表达系统大都是胞内表达,当蛋白分泌过多时会形成包涵体,你的怀疑很有道理,你可以尝试把基因转到芽孢杆菌营养缺陷菌株里面,表达的就成了胞外蛋白了,你也可以改造一下大肠杆菌,让胞内分泌到胞外,(纤维素酶作为融合蛋白在大肠杆菌中的应用及其分泌机制的研究)你可以参考一下这篇文献,总体上应该仔细查一下你的蛋白是分泌的形式再做决定。
2楼2018-11-08 10:03:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

尿素就是让蛋白变性溶解,溶解时加还原剂打开二硫键
3楼2018-11-08 10:25:31
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503276866

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是不是尿素浓度太低,包涵体没有溶解形成的硬块,可能不是蛋白变性的原因,你测试下看看
没有最好只有更好
4楼2018-11-21 14:34:51
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