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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒保存一段时间后中间插入160bp
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Vivicookie

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒保存一段时间后中间插入160bp 已有2人参与

一个确定插入片段序列正确的质粒和甘油菌分别保存半年后，再次用质粒扩增同一片段却在序列中间多160bp （原目的片段序列正确，仅中间插入，有插入序列但查不到是什么）甘油菌提质粒也是这个问题。请问这个可能是什么原因？

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1楼 2018-01-10 07:21:19
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阿门阿前1991

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那就是pcr的过程中引入的，用高保真酶试一下。
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总会出现一个温柔的人，让你变得温暖，然后默默离开。
2楼2018-01-10 16:52:22
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
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2楼: Originally posted by 阿门阿前1991 at 2018-01-10 16:52:22
那就是pcr的过程中引入的，用高保真酶试一下。

会引入这么多吗？插入片段还是在中间~我们也遇到过类似的问题，用高保真酶扩增的时候也是这样子，之后直接送的质粒测序，显示插入了，最后就只能重新构建了
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···
3楼2018-01-11 09:38:07
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Vivicookie

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小冀- at 2018-01-11 09:38:07
会引入这么多吗？插入片段还是在中间~我们也遇到过类似的问题，用高保真酶扩增的时候也是这样子，之后直接送的质粒测序，显示插入了，最后就只能重新构建了...

一直用高保真酶的，原来质粒和保存的甘油菌都是这个问题。我昨天重新克隆的序列就没问题了

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4楼2018-01-11 10:07:02
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小冀-

版主 (著名写手)

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引用回帖:
4楼: Originally posted by Vivicookie at 2018-01-11 10:07:02
一直用高保真酶的，原来质粒和保存的甘油菌都是这个问题。我昨天重新克隆的序列就没问题了
...

一开始我们都是在菌里保藏质粒，会出现这样的问题，现在都是把质粒提出来冻藏保存，就很少出现了
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···
5楼2018-01-11 10:19:46
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Vivicookie

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小冀- at 2018-01-11 10:19:46
一开始我们都是在菌里保藏质粒，会出现这样的问题，现在都是把质粒提出来冻藏保存，就很少出现了...

请问质粒在多少度冻存？

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6楼2018-01-12 09:18:00
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
6楼: Originally posted by Vivicookie at 2018-01-12 09:18:00
请问质粒在多少度冻存？
...

我们保藏在-20
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···
7楼2018-01-15 09:40:40
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

有些质粒在大肠杆菌里会自动重组，或者跟大肠杆菌的genome recommbination
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
8楼2018-01-15 12:54:29
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