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[交流] 做过非变性凝胶电泳的请进---奖励金币

我有个碱性蛋白等电点是9.3 想跑个非变性凝胶电泳
哪位有详细的步骤啊
或者有做个类似实验的
帮帮我下咯
我的qq 313397316
或者把步骤发在上面吧
小妹万分感谢一切好的步骤都有奖励哦。。。

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1楼 2009-03-03 14:22:50

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huyuxia

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帮帮我吧

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2楼2009-03-06 19:37:12

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huangyeke

铜虫 (正式写手)

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专业: 生物科学

★ ★ ★ ★
huyuxia(金币+1):谢谢参与
huyuxia(金币+3,VIP+0):不错谢谢 3-6 22:43

工作液配制
1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；
2. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存；
3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存；
4. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4℃ 贮存；
5. 2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存；
6. 10%APS；
7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；
8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O
电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）
1. 碱性非变性胶    17%分离胶(10 ml)    4%堆积胶(5 ml)
2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml    0.5ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)    2.5ml
4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)    1.25ml
5. 水    3.2ml
6. 10%APS 35 μl
7. TEMED 15 μl
8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到1L
电泳条件 :100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
染色和脱色:取出胶板于0.25%考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。
分离碱性蛋白
要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：
1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；
2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；
3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5
将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂
实验操作同分离酸性蛋白。