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微生物测序样本提取及送样建议
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炙手可热的第三代测序技术在组学研究界可谓是家喻户晓。不论是Pacbio RS II，还是升级版的Pacbio Sequel，都能以惊人的效率对基因组和转录组进行解码，而这一切是我们在几年前做梦也想象不到的。 大家的目光都聚焦在三代测序仪本身及其功能上，不过，小编要提醒下大家，要享受仪器带来的便利，我们首先还得准备好测序样品，在微生物测序中，样本的准备从是确保获得高质量DNA的首要前提，而样本准备也正是让众多微生物科研工作者感到困扰的重要一步。新年伊始，我们无以为报，只想送您一些简单实际的微生物样本处理及送样建议，愿这些助力您的实验！ 微生物Denovo测序 1、样本准备 细菌含有多糖，脂多糖和培养基残留物，真菌中常含有蛋白质，次级代谢产物，色素及培养及残留物，这些都会影响提取DNA的纯度，样本选择是，腹肌对数生长期的菌体，采用合适的试剂盒提取，可采用额外试剂盒进行DNA的纯化。 2、TBC送样建议 （1）DNA样本避免反复冻融，避免紫外线、荧光染料等可能损伤DNA的环境或物质，请尽可能提供新制备的DNA，低温运输； （2）DNA溶解在TE buffer或EB buffer中； （3）样品要求无色、透明、不粘稠； （4）凝胶电泳结果：主条带明显无明显降解现象，基因组DNA条带长度≥23kb(特殊种类请标注DNA大小)，胶孔无蛋白，无RNA污染； （5）DNA总量要求：真菌、放线菌门、昆虫、植物及海洋生物，单次建库起始DNA总量≥30μg(Qubit)，浓度>80ng/μL(Qubit)；其他样品，单次建库起始DNA总量≥15μg(Qubit)，浓度>40ng/μL(Qubit)； 微生物Meta测序 16S rDNA序列（在所有物种中高度保守）是最常用的细菌分类标准，通过提取环境样品的DNA，并扩增其中16S rDNA基因；通过检测16S rDNA 序列的变异和丰度，反映环境样本中细菌的分类和丰度。16S rDNA 有9个高变区，V6,V3,V4 区可以用来鉴定绝大多数细菌，基于Illumina HiSeq 2000平台的16S rDNA测序可以将V6,V3,V4区正反向读通，提供环境样本物种分类，物种丰度，种群结构，系统进化，群落比较等诸多信息，在微生物分类鉴定，微生态研究方等面起到重要作用。 1、样本准备 一、活体样本采集方法 1、粪便样本采集 采集人粪便时需新鲜的，建议采集中后部粪便，用无菌勺子取粪便内部样本，一式三份，样本量建议在10g以上，采集后保存在专门的粪盒中，迅速-80℃冷冻，干冰运输寄送。采集小鼠等动物粪便前，小鼠放进干净的铺有消毒滤纸的笼子里，排便后立即收集，采集量建议在3g以上，保存在无菌离心管中，迅速-80℃冷冻，干冰运输寄送。 二、土壤、水体常见样本采集方法 1、普通土壤样本采集 据研究目的确定土壤的取样深度和范围，每个样品多点取样后混匀。其中需要注意的是，要避免外界如植物根、昆虫对采集的影响，另外，采集前所用工具、采集袋等需灭菌处理，采集量建议30g以上，采集时要注意去除杂质，采集后迅速液氮冷冻，-80℃保存，干冰运输寄送。 2、水体样本采集 取样量，一般建议至少5L水样，如水体杂质较多，建议先用0.45μm滤膜过滤，再用0.22μm滤膜过滤，每片滤膜可过滤300ml到500ml水样，过滤后将滤膜放置在无菌离心管中液氮冷冻，-80℃保存，干冰运输寄送。 3、活性污泥及沉积物样本采集 1，活性污泥：从曝气池中取25mL悬浮的活性污泥样本放入无RNA酶的管中，迅速放入液氮并运送到实验室提取DNA； 2，地表沉积物：取距地表0-10cm的地表沉积物，每个位点取1-2kg的沉积物装入消毒聚乙烯塑料袋中，立刻置于0℃运到实验室进行DNA提取。 2、TBC送样建议 （1）单个扩增样本 样品需求量：2μg。 样品浓度：≥30ng/μL，以Qubit检测结果为准。 样品纯度：OD260/280=1.8-2.0 样品完整度：DNA无降解，主条带明显无明显降解现象。 （2）多个扩增产物混合样本 样品需求量：500μg。 样品浓度：≥10ng/μL，以Qubit检测结果为准。 样品纯度：OD260/280=1.8-2.0 样品完整度：DNA无降解，主条带明显无明显降解现象。 [ Last edited by snoopytbw on 2018-4-20 at 09:11 ] |
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