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枯草感受态的制备
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| 群里的大神们求助，做枯草的感受态，同时做了模式菌种WB168和野生菌株，转化质粒进去培养后涂布抗性平板，结果168的能转进去，野生菌株下的感受态质粒转不进去，做了3遍了都是这种情况，后期要用这株野生菌，请问要怎么解决啊，拜托各位指点指点！ |
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一、试剂配制 1. SP 盐 0.2%( NH4)2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 柠檬酸钠。 2. CAYE (100×) 2 % Casamino acid(柠檬酸钠），10%酵母膏。 3. SPI 培养基 SP 盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100×CAYE 溶液。 4. SPII 培养基 SPI 培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2溶液。 5. SP-A Salts Solution（盐溶液）(500 ml) （1）0.4% (NH4)2SO4：2 g （2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g （3）1.2% KH2PO4 ：6 g （4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g （5）121°C灭菌20 min。 6. SP-B Salts Solution(500 ml) （1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g （2）121°C灭菌20 min。 7. 100×CAYE Solution(100 ml) （1）2% Casamino acid ：2 g酪蛋白水解物 （2）10% Yeast Extract：10 g （3）121°C灭菌20 min。 8. SPI Medium(20 mL) SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL (1%V)Glucose酵母提取物(50%w/v，115°C灭菌20 min) ：200 μL (1%V)100×CAYE：200 μL 10. SPII Medium(6 mL) SPI Medium：5.88mL (1%V)50mM CaCl2 ：60μL (1%V)250mM MgCl2：60μL 11. 100×EGTA Solution 10mmol/L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH 至pH8.0。 二、实验步骤 1. 准备新鲜的168 单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB 平板，37°C 培养箱培养12 h。 2. 转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB 培养基中，37°C，250 r/min 培养过夜。 3. 第二天上午取160 μl 培养液转接至8 ml SPI 培养基中，37°C，250 r/min 培养至对数生长末期(168 约4-5 h)。 4. 取0.2 ml 生长至对数期末的培养液至2 ml SPII 培养基中，37 °C，100 r/min 培养90 分钟。 5. 在上述SPII培养基的菌体中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培养10 分钟。 6. 将上述处理后的菌液分装成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA(DNA 量不能过高，不超过5 μg)，再于37 °C，250 r/min 培养90 分钟，取菌液涂布筛选平板。  |
4楼2018-06-07 20:45:27
5楼2018-07-19 23:13:20
