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一文读懂，免疫组化原理及实验步骤
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免疫组化，病理学实验的常用技术，看似容易，其实处处存在陷阱，稍微一不留意，就会掉入坑中而无法自拔。中洪免疫组化小王子：“是这个理，今天我就豁出去，将我多年的心得和经验奉献给你了！” （请耐心花2分钟阅读完本文，建议推荐给小伙伴一起学） 1 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒，如图1）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 2 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片 3 操作步骤 ①石蜡切片制作 1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h 2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h 3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min 4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织 5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带 6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上 （洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸） 7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h 4 SP三步法 1、 脱蜡：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min，或60℃恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min 2、 水化：无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min 3、 PBS冲洗2-3次，每次5min 4、 阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性 5、 PBS冲洗2-3次，每次5min 6、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温 7、PBS冲洗2-3次，每次5min 8、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体 9、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min） 10、PBS冲洗2-3次，每次5min 11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h 12、PBS冲洗2-3次，每次5min 13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h 14、PBS冲洗2-3次，每次5min 15、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞） （显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀） （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液） 16、自来水冲洗10分钟终止反应 17、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化 18、自来水冲洗10-15min 19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检； 5 SABC法 1)脱蜡、水化。 2)PBS洗两次各5分钟。 3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。 4)抗原修复。 5)PBS洗5分钟。 6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。 8)PBS洗三次每次2分钟。 9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。 10)PBC洗3次每次2分钟。 11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。 12)PBS洗4次每次5分钟。 13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。 14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 15)脱水、透明、封片、镜检。 结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。 |
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