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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 质粒转染
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车前子ing

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒转染 已有1人参与

大家好，我在质粒转染时遇到了如下问题，还请各位大神帮帮忙，谢谢
根据导师要求在确定细胞密度为30%-40%时开始质粒转染，转染前换无血清培养基，转染后6小时换2%培养基，但发现细胞大量死亡，重复实验结果还是一样，后来才知道是细胞太稀而lip2000有毒，可能导致细胞死亡，所以后来在等细胞长到50%-60%才开始转染，同样转染前换无血清培养基，转然后6小时换2%培养基，但这次的发现不是细胞大量死亡而是细胞疯长，我一般转染18小时，等到18小时候12孔板的每孔中细胞长得满满的，后来我又等到转染完后直接不更换培养基，这样没有血清，细胞肯定就不长了，可是在无血清培养基的情况下细胞还是依旧疯长，后来换了LTX转染，效果一样，还是疯长，实在不知道哪里出问题了，还请大家帮忙分析一下，非常感谢！
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1楼 2017-12-09 10:58:47
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匿名

本帖仅楼主可见
2楼2017-12-09 13:53:38
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ywwabc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
车前子ing: 金币+10, ★★★很有帮助 2017-12-14 15:17:36
就像你写的，lip2000有毒，不换液就不长了，，转染6h换液后疯狂长，生长速度是不是比不转染的正常细胞快？？那么需要考虑是不是转染的基因造成的呢？我一般就是换无血清2h后转染6h然后全部换液，换新鲜的完全培养基，没有出现你说的过夜就长满了的情况额。。。
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3楼2017-12-11 13:23:28
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车前子ing

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by ywwabc at 2017-12-11 13:23:28
就像你写的，lip2000有毒，不换液就不长了，，转染6h换液后疯狂长，生长速度是不是比不转染的正常细胞快？？那么需要考虑是不是转染的基因造成的呢？我一般就是换无血清2h后转染6h然后全部换液，换新鲜的完全培养基 ...

好的，谢谢，我试一下。还有要做间接免疫荧光的话，细胞密度最好长到多少转染的话最好，另外如果没有特异性抗体，IFA还能做出结果吗
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4楼2017-12-14 15:14:07
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车前子ing

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by ywwabc at 2017-12-11 13:23:28
就像你写的，lip2000有毒，不换液就不长了，，转染6h换液后疯狂长，生长速度是不是比不转染的正常细胞快？？那么需要考虑是不是转染的基因造成的呢？我一般就是换无血清2h后转染6h然后全部换液，换新鲜的完全培养基 ...

好的，谢谢，我试一下。还有要做间接免疫荧光的话，细胞密度最好长到多少转染的话最好，另外如果没有特异性抗体，IFA还能做出结果吗
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5楼2017-12-14 15:15:18
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车前子ing

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by ywwabc at 2017-12-11 13:23:28
就像你写的，lip2000有毒，不换液就不长了，，转染6h换液后疯狂长，生长速度是不是比不转染的正常细胞快？？那么需要考虑是不是转染的基因造成的呢？我一般就是换无血清2h后转染6h然后全部换液，换新鲜的完全培养基 ...

好的，谢谢，我试一下。还有要做间接免疫荧光的话，细胞密度最好长到多少转染的话最好，另外如果没有特异性抗体，IFA还能做出结果吗
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6楼2017-12-14 15:17:07
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ywwabc

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by 车前子ing at 2017-12-14 15:17:07
好的，谢谢，我试一下。还有要做间接免疫荧光的话，细胞密度最好长到多少转染的话最好，另外如果没有特异性抗体，IFA还能做出结果吗...

免疫荧光检测的话，细胞单层平铺就好，不要有堆积的，，最好也不要太少，太少会被质疑结果，，我一般都在50-80%吧，至于做IFA，没有特异性抗体，那荧光还是你需要检测的蛋白吗？没听说过额，，估计是我孤陋寡闻了
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7楼2017-12-14 15:21:08
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ywwabc

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6楼: Originally posted by 车前子ing at 2017-12-14 15:17:07
好的，谢谢，我试一下。还有要做间接免疫荧光的话，细胞密度最好长到多少转染的话最好，另外如果没有特异性抗体，IFA还能做出结果吗...

而且我转染前细胞接种量是根据正常细胞增殖速度及转染时间变化的，，一般在40%-70%不等，大部分在50%的样子
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8楼2017-12-14 15:23:05
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车前子ing

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by ywwabc at 2017-12-14 15:21:08
免疫荧光检测的话，细胞单层平铺就好，不要有堆积的，，最好也不要太少，太少会被质疑结果，，我一般都在50-80%吧，至于做IFA，没有特异性抗体，那荧光还是你需要检测的蛋白吗？没听说过额，，估计是我孤陋寡闻了...

我现在手头就只有一个非特异性的抗体，每次做完后发现只要有核的地方就有荧光，导师说我的目的蛋白表达量不可能那么高，说都是非特异性的，我也知道是非特异性的啊，我跟导师说了没有特异性抗体我做不出来，结果导师说让我调整荧光比例，也就是说让我调整二抗的比例，但我做了，结果还是跟之前一样，都是荧光，同时我设了绿色荧光蛋白GFP做阳性对照，转染效率大概是30%，荧光很明显，还设了阴性对照，阴性对照和我的目的质粒用的是同一个抗体，结果阴性对照也有荧光，跟目的质粒的结果差不多，这真的是我操作有问题导致的吗
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9楼2017-12-14 15:32:29
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ywwabc

新虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by 车前子ing at 2017-12-14 15:32:29
我现在手头就只有一个非特异性的抗体，每次做完后发现只要有核的地方就有荧光，导师说我的目的蛋白表达量不可能那么高，说都是非特异性的，我也知道是非特异性的啊，我跟导师说了没有特异性抗体我做不出来，结果导 ...

你都说了是非特异性的抗体，那么除了识别你的目的蛋白，应该还识别别的蛋白，，所以空白细胞有荧光很正常啊！调整二抗的比例？调整这个有啥用呢？降低荧光率吗？不靠谱啊，还有，你的抗体是什么抗体？为啥有非特异性呢？好怪异
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10楼2017-12-14 16:00:02
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