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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » 杂交瘤细胞WB鉴定
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dalian0725

新虫 (小有名气)

[求助] 杂交瘤细胞WB鉴定 已有1人参与

求助各位大神  制备单抗时   免疫原是纯化的蛋白   筛选当中所用到的是另外一种纯化的蛋白  收集三克后的细胞上清液  用第二种蛋白进行WB检测   但是未经纯化   只是将蛋白诱导表达后提取包涵体后用尿素溶解的蛋白与杂交瘤细胞上清液进行WB鉴定   出现很多很多杂带，当然也出现了目的条带，想问一下  为什么会有这么多杂带？
补充一下  将第二种纯化的蛋白与杂交瘤细胞上清液进行WB鉴定  是正常的
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dalian0725 dalian0725

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1楼 2017-12-04 08:45:53
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ywwabc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很正常啊，第二种蛋白不纯，里面有掉标签啊之类的情况导致蛋白分子量量不一样了啊，例如GST的重组蛋白，掉标签后，分子量就小了20多KD，蛋白跑个SDS就知道啦
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dalian0725
2楼2017-12-05 14:27:18
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dalian0725

新虫 (小有名气)
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可是我进行筛选的时候用的是无标签的纯化蛋白   筛选到的应该是只有针对纯化蛋白的杂交瘤细胞呀？
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3楼2017-12-06 08:25:18
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dalian0725

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by ywwabc at 2017-12-05 14:27:18
很正常啊，第二种蛋白不纯，里面有掉标签啊之类的情况导致蛋白分子量量不一样了啊，例如GST的重组蛋白，掉标签后，分子量就小了20多KD，蛋白跑个SDS就知道啦

可是我进行筛选的时候用的是无标签的纯化蛋白   筛选到的应该是只有针对纯化蛋白的杂交瘤细胞呀？
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4楼2017-12-06 08:26:26
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ywwabc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by dalian0725 at 2017-12-06 08:26:26
可是我进行筛选的时候用的是无标签的纯化蛋白   筛选到的应该是只有针对纯化蛋白的杂交瘤细胞呀？...

那你把蛋白跑个SDS看一下，也许是切了标签，但是切的可能不是100%切掉呢？或者有的酶切的时候导致蛋白也别水解成不同分子量的呢？是吧，这种重组蛋白一般都很难是单一条带的，，需要一点点调整抗体及蛋白浓度，才会把杂带或者你不想要的带给优化的
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dalian0725
5楼2017-12-06 10:45:27
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dalian0725

新虫 (小有名气)
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不是     我解释一下    免疫的时候用的是带有标签和目的蛋白的融合蛋白    所以在筛选的时候用的是另外重新构建表达的只有目的蛋白（经过切胶纯化）     后来想做一下单抗的WB鉴定    结果发现    杂交瘤细胞的上清液和筛选时所用的那株菌反应有很多杂带（WB鉴定时没有用纯化的蛋白，只是将其诱导表达，用尿素溶解后直接进行跑胶，然后进行WB）
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6楼2017-12-06 11:03:49
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dalian0725

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
5楼: Originally posted by ywwabc at 2017-12-06 10:45:27
那你把蛋白跑个SDS看一下，也许是切了标签，但是切的可能不是100%切掉呢？或者有的酶切的时候导致蛋白也别水解成不同分子量的呢？是吧，这种重组蛋白一般都很难是单一条带的，，需要一点点调整抗体及蛋白浓度，才会 ...

不是     我解释一下    免疫的时候用的是带有标签和目的蛋白的融合蛋白    所以在筛选的时候用的是另外重新构建表达的只有目的蛋白（经过切胶纯化）     后来想做一下单抗的WB鉴定    结果发现    杂交瘤细胞的上清液和筛选时所用的那株菌反应有很多杂带（WB鉴定时没有用纯化的蛋白，只是将其诱导表达，用尿素溶解后直接进行跑胶，然后进行WB）
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7楼2017-12-06 11:06:41
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ywwabc

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7楼: Originally posted by dalian0725 at 2017-12-06 11:06:41
不是     我解释一下    免疫的时候用的是带有标签和目的蛋白的融合蛋白    所以在筛选的时候用的是另外重新构建表达的只有目的蛋白（经过切胶纯化）     后来想做一下单抗的WB鉴定    结果发现    杂交瘤细胞的上 ...

意思是用的细菌裂解液做的WB？
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dalian0725
8楼2017-12-06 11:43:08
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ywwabc

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引用回帖:
7楼: Originally posted by dalian0725 at 2017-12-06 11:06:41
不是     我解释一下    免疫的时候用的是带有标签和目的蛋白的融合蛋白    所以在筛选的时候用的是另外重新构建表达的只有目的蛋白（经过切胶纯化）     后来想做一下单抗的WB鉴定    结果发现    杂交瘤细胞的上 ...

如果说是用这种方法检测，，那杂就很正常了啊，这种裂解液里面蛋白很杂的，各种各样的，单抗是识别一个位点，，但是有很多蛋白位点是一样的，意思就是说可以识别相同位点的各种蛋白啊
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9楼2017-12-06 11:55:55
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dalian0725

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8楼: Originally posted by ywwabc at 2017-12-06 11:43:08
意思是用的细菌裂解液做的WB？...

也不是直接裂解液   就是超声裂解之后提取包涵体（用不同浓度的尿素进行洗涤）  最后用尿素溶解  也是有很多杂带的
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10楼2017-12-06 13:42:26
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