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晋鹏版主 (知名作家)
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[优秀文章推荐]中大构建了一种高效的Cas9驱动的基因转录激活方法 已有3人参与
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CRISPR SAM（synergistic activation mediator）采用切割活性缺失的dCas9蛋白融合VP64转录激活蛋白，加上能与RNA结合蛋白MS2的sgRNA2.0，特异性识别并结合目标基因的启动子。MS2蛋白上连接p65和HSF1转录激活蛋白。通过多种转录激活蛋白的协同作用，能更好的模拟细胞内转录激活（图1，CRISPR/Cas9 SAM原理）。研究表明，单一位点SAM的转录激活效果远高于多个位点dCas9-VP64的转录激活效果。 与传统转基因相比，CRISPRa系统是通过激活细胞内源基因表达来提高目标基因的表达量，它不需要转入外源DNA，降低了由于转基因造成的基因组不可逆转突变的风险。另外，结合gRNA文库，可同时激活多个基因的转录与表达。此前Gain-Of-Function筛选主要是通过cDNA文库实现，但由于部分cDNA克隆难度较大致使cDNA文库覆盖率不完全；同时cDNA文库并不能涵盖每个基因的所有转录本；基因的表达也会受到细胞内部元件的调控。利用dCas9-VP64-gRNA系统进行的高通量筛选可在同一个启动子上设计多个gRNA来提高基因的转录活性，基因转录本也会更为全面。已有研究表明，利用CRISPR/Cas9系统选择性的上调基因表达，可以用来诱导干细胞的分化或重编程、刺激组织再生、补偿遗传缺陷、激活已经失活的抑癌基因、进行基因功能筛选以及合成基因回路。 例如：当转录激活子VP64与dCas9融合后，能够促进靶向基因的表达。但后续实验证实，若直接将dCas9与VP64融合，只能较小程度地提高转录水平。人们试着将VP64与dCas9的氨基端和羧基端融合或将dCas9与10拷贝数的VP64融合，均能提高CRISPR-dCas9对基因表达的促进作用。 转录激活子VP64与dCas9融合可以促进靶向基因的表达，但只能较小程度地提高转录水平。目前报道的三种基于dCas9技术的转录激活系统（VPR, SAM和SunTag）在动物细胞中得到很好的应用，但在植物中还没有一种有效的转录激活系统，该研究团队报道了一种植物中的高效的转录激活系统 dCas9–TV，与 dCas9–VP64相比， dCas9–TV在单基因或者多基因的激活方面都表现的比较强的激活效率，另外研究表明，该系统同样适用动物细胞。 |
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渊博震天
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