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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 大肠杆菌的稀释平板计数，老是出不来菌落，求助各位大神
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liuyi8203

金虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by abc213 at 2017-11-13 08:29:57
那10^-2是什么原因导致的，您知道吗？应该不是没混匀的问题吧，我稀释振荡时间挺长的...

涂布的时候，涂布棒没有凉就涂了，太烫了，把菌烫死了
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11楼2017-11-13 10:44:06
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abc213

银虫 (初入文坛)
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11楼: Originally posted by liuyi8203 at 2017-11-13 10:44:06
涂布的时候，涂布棒没有凉就涂了，太烫了，把菌烫死了...

这个问题我很注意的，我是等涂布棒完全冷却了才去涂的，是从高稀释度到低稀释度涂的，中间不更换涂布棒，应该不是涂布棒太烫的原因

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12楼2017-11-13 10:50:29
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我爱我熊

铜虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by abc213 at 2017-11-13 10:43:14
我是先培养一个菌落平板，划线培养24h,之后挑单菌落到5ml的无菌生理盐水里面，振荡均匀，这就是未稀释前的菌悬液，我这样操作可以吗？之后的平板我是放在4℃的冰箱里保存备用，只保存一个星期。还想问下，您是怎么 ...

一般大肠杆菌24小时单菌落应该长得很好了，一个单菌落加到5ml盐水的菌悬液会大于0.5麦氏，菌悬液制作应该没有问题。而你涂布的只有第一个稀释梯度看着比较正常。那考虑1、是不是涂布这一个步骤的问题，涂布棒是一次性的还是玻璃的。一次性的每个板子都要换一个涂布棒；如果是玻璃的则需要没次烧一下，然后等着冷却好再开始涂布
2、培养基的问题，一般都是用营养琼脂这一类基础培养基，培养基表面需要保持一定的干燥，不能太湿或者太干。
3、如果想要做一个比较准确的计数，还是需要配制麦氏比浊管。1%硫酸、1.175%氯化钡   0.5麦氏管：50微升+9950微升
4、先把菌纯化再开始实验
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abc213
13楼2017-11-13 11:33:40
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我爱我熊

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 我爱我熊 at 2017-11-13 11:33:40
一般大肠杆菌24小时单菌落应该长得很好了，一个单菌落加到5ml盐水的菌悬液会大于0.5麦氏，菌悬液制作应该没有问题。而你涂布的只有第一个稀释梯度看着比较正常。那考虑1、是不是涂布这一个步骤的问题，涂布棒是一次 ...

50微升氯化钡+9950微升硫酸
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14楼2017-11-13 11:38:09
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abc213

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
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13楼: Originally posted by 我爱我熊 at 2017-11-13 11:33:40
一般大肠杆菌24小时单菌落应该长得很好了，一个单菌落加到5ml盐水的菌悬液会大于0.5麦氏，菌悬液制作应该没有问题。而你涂布的只有第一个稀释梯度看着比较正常。那考虑1、是不是涂布这一个步骤的问题，涂布棒是一次 ...

1.涂布棒是玻璃的，由于是从高稀释度到低稀释度涂的（10^-6—10^-1），所以也没有更换玻璃棒和灼烧玻璃棒，涂得时候是等涂布棒完全冷却后涂的
2.培养基之前用的就是普通的营养琼脂培养基，这次换成了胰蛋白胨大豆琼脂培养基，想看看是不是培养基对细菌菌落的影响
3.其实我主要需要的是稀释到一定程度可计数的菌落（30—300左右），具体菌落是多少个
4.纯化是不是就是对大肠杆菌不断地平板划线培养，然后挑单菌落继续培养？
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15楼2017-11-13 12:37:44
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我爱我熊

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by abc213 at 2017-11-13 12:37:44
1.涂布棒是玻璃的，由于是从高稀释度到低稀释度涂的（10^-6—10^-1），所以也没有更换玻璃棒和灼烧玻璃棒，涂得时候是等涂布棒完全冷却后涂的
2.培养基之前用的就是普通的营养琼脂培养基，这次换成了胰蛋白胨大豆 ...

TSA其实和营养琼脂差别不大，可以试试。
30-300应该在-4次方这个稀释度左右，具体看板子结果
纯化就是划线分离出单菌落，镜检格兰染色，方便的话简单鉴定一下（IMVC）。靛基质阳性，甲基红阳性，VP阴性，柠檬酸盐阴性

额。。。其实，你应该重复一下你的实验，说不定就结果就正常了，也许就不用分析这么多原因了
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16楼2017-11-13 13:19:25
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abc213

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 我爱我熊 at 2017-11-13 13:19:25
TSA其实和营养琼脂差别不大，可以试试。
30-300应该在-4次方这个稀释度左右，具体看板子结果
纯化就是划线分离出单菌落，镜检格兰染色，方便的话简单鉴定一下（IMVC）。靛基质阳性，甲基红阳性，VP阴性，柠檬酸盐 ...

好的，谢谢了
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17楼2017-11-13 14:23:44
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gufanzhch

铁虫 (初入文坛)
大肠杆菌不会这么大，杂菌污染了；

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18楼2017-11-22 15:49:52
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mayfun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我以前也遇到过这种情况，不知道你加了多少体积的菌液涂板？看图片推测你的初始菌液浓度只有10的4次方左右。如果浓度有10的8次方，那么稀释10倍的那个板子上的细菌是连成片长的，根本数不了的。建议你用0.5麦氏浊度（对应浓度为0.5*10的8次方的菌液）的比色管和你的菌液对比，看浊度是不是和他差不多。或者你可以测下吸光度，10的8次方浓度的细菌OD600的值有1.0左右。
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19楼2017-11-24 15:22:36
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ganfighter

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by abc213 at 2017-11-13 08:29:57
那10^-2是什么原因导致的，您知道吗？应该不是没混匀的问题吧，我稀释振荡时间挺长的...

你留意一下你的涂布棒，可能是因为没有等到它的温度降下来就看是涂了，导致高温杀死了大量细菌，从而导致2号板的结果。
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20楼2018-04-16 17:04:39
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