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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 反转录后的cDNA当模板扩增
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mochenmi

铜虫 (小有名气)

[求助] 反转录后的cDNA当模板扩增 已有2人参与

最近做酵母双杂交，需要连AD质粒，有几个基因长4000多bp。拿cDNA当模板老是扩不出，KOD什么的都试过，有没有扩增的好办法？
另外请教下，一定要拿cDNA当模板吗？酵母能识别内含子嘛？

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1楼 2017-11-03 16:51:25
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199006287956

木虫 (著名写手)
看看反转录酶的说明书，有的反转录效率没那么高，不能达到4000bp的长度

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追求不惜，奋斗不息
2楼2017-11-03 16:57:34
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酵母可以识别内含子，部分酿酒酵母的基因也是有内含子的，但是植物的内含子未必能够准确识别，我们实验室以前有个师弟要扩ACC基因，7000bp，也扩出来呀，Kod扩个20kb没问题，关键是你的基因要在你的总RNA中要表达，意思是你最好用混合样品提取总RNA，反转录酶买宝生物或者Invitrogen的好一些，扩增长片段的引物最好长一点27-30 bp，延伸的时间也长一点，不要迷信说明书推荐的延伸时间，要知道他们扩增实验做了上万次，模版很标准，所以容易扩，不然你让他们换个基因扩增，分分钟难到他们
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3楼2017-11-03 18:37:34
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吕葱葱同学

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by gastrodia at 2017-11-03 18:37:34
酵母可以识别内含子，部分酿酒酵母的基因也是有内含子的，但是植物的内含子未必能够准确识别，我们实验室以前有个师弟要扩ACC基因，7000bp，也扩出来呀，Kod扩个20kb没问题，关键是你的基因要在你的总RNA中要表达， ...

我最近要克隆一个9000的基因，用KOD扩不出来，老板说有可能反转录的时候，根本没有转录完全，建议设计多条引物逐一往5'端反转录，这样可以把这个基因的全部CDS分片段扩下来，然后再用试剂盒把片段重组在一起，最后用首尾引物扩下片段全长，我觉得好麻烦啊，一边着手做，一边还是要尝试直接从cDNA中扩全长。你师弟扩下7000的带应该是这个基因本身转录水平就很高，加上rNA提的质量很好。我试过很多次，用自己的引物及通用引物都没有扩下过全长呢。
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好好学习
4楼2017-11-26 16:58:23
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