应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 反转录后的cDNA当模板扩增
41/1返回列表
查看: 1732  |  回复: 3
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

mochenmi

铜虫 (小有名气)

[求助] 反转录后的cDNA当模板扩增 已有2人参与

最近做酵母双杂交，需要连AD质粒，有几个基因长4000多bp。拿cDNA当模板老是扩不出，KOD什么的都试过，有没有扩增的好办法？
另外请教下，一定要拿cDNA当模板吗？酵母能识别内含子嘛？

发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-11-03 16:51:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

199006287956

木虫 (著名写手)
看看反转录酶的说明书，有的反转录效率没那么高，不能达到4000bp的长度

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
追求不惜，奋斗不息
2楼2017-11-03 16:57:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酵母可以识别内含子，部分酿酒酵母的基因也是有内含子的，但是植物的内含子未必能够准确识别，我们实验室以前有个师弟要扩ACC基因，7000bp，也扩出来呀，Kod扩个20kb没问题，关键是你的基因要在你的总RNA中要表达，意思是你最好用混合样品提取总RNA，反转录酶买宝生物或者Invitrogen的好一些，扩增长片段的引物最好长一点27-30 bp，延伸的时间也长一点，不要迷信说明书推荐的延伸时间，要知道他们扩增实验做了上万次，模版很标准，所以容易扩，不然你让他们换个基因扩增，分分钟难到他们
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2017-11-03 18:37:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

吕葱葱同学

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by gastrodia at 2017-11-03 18:37:34
酵母可以识别内含子，部分酿酒酵母的基因也是有内含子的，但是植物的内含子未必能够准确识别，我们实验室以前有个师弟要扩ACC基因，7000bp，也扩出来呀，Kod扩个20kb没问题，关键是你的基因要在你的总RNA中要表达， ...

我最近要克隆一个9000的基因，用KOD扩不出来，老板说有可能反转录的时候，根本没有转录完全，建议设计多条引物逐一往5'端反转录，这样可以把这个基因的全部CDS分片段扩下来，然后再用试剂盒把片段重组在一起，最后用首尾引物扩下片段全长，我觉得好麻烦啊，一边着手做，一边还是要尝试直接从cDNA中扩全长。你师弟扩下7000的带应该是这个基因本身转录水平就很高，加上rNA提的质量很好。我试过很多次，用自己的引物及通用引物都没有扩下过全长呢。
赞一下(1人) 回复此楼
好好学习
4楼2017-11-26 16:58:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 mochenmi 的主题更新
41/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 5/250 2026-11-02 00:47 by xzcv0Tehd8lQ
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 8/400 2026-11-02 00:37 by xzcv0Tehd8lQ
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 11/550 2026-11-02 00:21 by xzcv0Tehd8lQ
[找工作] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 8/400 2026-11-02 00:15 by xzcv0Tehd8lQ
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 19/950 2026-11-02 00:02 by xzcv0Tehd8lQ
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 16/800 2026-11-01 23:55 by xzcv0Tehd8lQ
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 7/350 2026-11-01 22:01 by xzcv0Tehd8lQ
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 10/500 2026-11-01 21:52 by xzcv0Tehd8lQ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 11/550 2026-11-01 21:35 by xzcv0Tehd8lQ
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 17/850 2026-11-01 21:26 by xzcv0Tehd8lQ
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 5/250 2026-11-01 20:03 by xzcv0Tehd8lQ
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 8/400 2026-11-01 16:58 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 22/1100 2026-11-01 16:35 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 越来越担心硕士毕业后没有竞争力了 +9 zuesli 2026-10-27 15/750 2026-11-01 12:59 by Equinoxhua
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 3/150 2026-11-01 12:53 by BCdvBAEpt3zm
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 7/350 2026-11-01 12:40 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 17/850 2026-11-01 12:24 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 11/550 2026-11-01 12:24 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 4/200 2026-11-01 11:01 by BCdvBAEpt3zm
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 26/1300 2026-11-01 10:22 by BCdvBAEpt3zm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭