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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » superdex75纯化蛋白 低盐反而出峰，高盐不出峰
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教洋文

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6楼: Originally posted by chaiyin1991 at 2018-03-05 15:41:16
superdex75是分子筛效应，你用盐相洗脱的原理是什么？

本意上选择缓冲液只是为了让蛋白呆在一个比较稳定，适合它的环境中，然后靠分子大小来分离。但是现在根据这些现象可以发现，他并不是依靠分子量来分离的。我问问题就是想请教大家对这种现象有没有什么解释

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11楼2018-04-24 16:57:38
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教洋文

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7楼: Originally posted by sungel520 at 2018-03-09 13:57:53
chaiyin1991正解。另外，你用水冲蛋白可能直接被冲出来了或者凝集堵柱子的可能性很大。

我尝试过柱子用水平衡，上样之后，走水，2cv也没蛋白峰出来。如果说是水对我的蛋白起了作用，理论应该直接下来的啊。所以更令人费解了

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12楼2018-04-24 16:59:52
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教洋文

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8楼: Originally posted by hc-material at 2018-04-23 11:03:11
额，有谁告诉你小于填料的物质会在1cv时出来呢？？？？？？75PG的分离范围是3000-80000，你的目标50000，进入孔内。先出来盐，是平衡时体系的盐，不分离过程出的盐，搞不明白分子筛的为啥缓冲液换来换取，你用含氯化 ...

蛋白50KD，怎么样都会比盐的分子量大吧，那不是应该比盐峰早出来。理论上50kd的蛋白在s75上出峰时间是约50-60ml，我里面的杂质蛋白55KD也确实是在50ml出峰了，之有目的蛋白50kd，没有在该出峰的位置出峰。

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13楼2018-04-24 17:02:33
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hc-material

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★
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10楼: Originally posted by 教洋文 at 2018-04-24 16:54:18
另外我试着用缓冲液冲过2cv，仍旧没有出峰，换水冲1cv时又出峰了。依照您的意思，我用缓冲液冲的cv还不够，可以再多冲几个cv是吗？
...

建议你不管用水还是用缓冲液，都先跑10个cv看看情况，然后在分析，一个过程中换缓冲液很难分析。缓冲液浓度很低，应该不会有疏水作用。从平衡到结束，不管啥让他整个过程完成，中间换缓冲液，结果不好分析。对了柱子装多高，需要装30cm以上，还有层析过程流速不宜太快。
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教洋文
14楼2018-04-24 17:03:47
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教洋文

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14楼: Originally posted by hc-material at 2018-04-24 17:03:47
建议你不管用水还是用缓冲液，都先跑10个cv看看情况，然后在分析，一个过程中换缓冲液很难分析。缓冲液浓度很低，应该不会有疏水作用。从平衡到结束，不管啥让他整个过程完成，中间换缓冲液，结果不好分析。对了柱 ...

柱子是GE10/6000的预装柱，120ml，60cm高。其实我还是不太理解您的意思，分子筛进去的东西难道不应该在1cv出来吗？除非有什么作用力抓住了蛋白或者蛋白聚集堵住了让它在柱子里面出不来，再加上盐分子量那么小都走出来了，蛋白如果正常不是早就改出来了吗？

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15楼2018-04-24 17:08:30
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chen_xiao_xu

银虫 (正式写手)
★
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分子筛不用换液分离的，如果想换液的话，可以换液。你的目标在50000，那有可能在三分之一位置出峰或者晚一些。

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16楼2018-04-26 21:30:58
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maoniuniu

新虫 (小有名气)
★
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学习一下，我也不是很明白

一般这种柱子非特异吸附应该很小很小吧

你的蛋白如果是高盐导致像前面虫友所说溶解性下降，应该在你上样前就能够观察到其在buffer中的稳定性如何，而且假如堵柱子，你应该能够看到反压的显著增高

一般都应该是 1 个 CV 可以将目的蛋白洗脱出来，可能有些会在 1 个 CV 后出来，但一般也是在 1.5 CV 前出来

你的情况有咨询过 GE 的工程师吗？
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教洋文
17楼2018-05-16 19:43:25
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教洋文

新虫 (初入文坛)
上样前样品在100mm Nacl里，有沉淀但很少，所以可以说蛋白在100mm盐中算是稳定。在整个纯化过程中柱子压力从0.11Mpa到0.14mpa，不知道这样算不算显著升高。

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18楼2018-05-17 13:22:34
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教洋文

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17楼: Originally posted by maoniuniu at 2018-05-16 19:43:25
学习一下，我也不是很明白

一般这种柱子非特异吸附应该很小很小吧

你的蛋白如果是高盐导致像前面虫友所说溶解性下降，应该在你上样前就能够观察到其在buffer中的稳定性如何，而且假如堵柱子，你应该能够看到反 ...

上样前样品在100mm Nacl里，有沉淀但很少，所以可以说蛋白在100mm盐中算是稳定。在整个纯化过程中柱子压力从0.11Mpa到0.14mpa，不知道这样算不算显著升高。
情况咨询过工程师，她们表示没见过这样的案例。
我现在是怀疑至少存在疏水吸附，所以在buffer中尝试加DMSO或者曲拉通看看。

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19楼2018-05-17 13:25:03
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