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yorkham

铜虫 (小有名气)

[交流] PCR模板不同,摸索的平台期循环数会变吗?

还是做半定量RT-PCR的问题,在摸索引物的最佳退火温度和循环数时,我先摸好退火温度,但摸循环数时换了模板(几个循环都用这个模板),也找到了平台期,但我想问,假如我再换个模板的话,这个平台期会不会因模板不同而改变?(我做污染物浓度梯度对基因表达影响)
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

呃,这样吧,诀窍就是,抽完RNA,定量,摸好循环数
然后以后要重复实验的话,就必需加入当量的RNA去RT(浓了就稀释,少了就多加)
2楼2009-02-17 16:37:08
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yorkham

铜虫 (小有名气)

我知道,我做梯度试验,一个正常组,一个处理组,提完RNA,RT时调好了模板的量(使加入的RNA量一样),但是用正常组模板摸的循环数和用处理组模板摸的循环数会一样吗?我只做了35循环的,这两个处理组的灰度是不一样的(一样的话我设的梯度也没意义了,呵呵)
3楼2009-02-17 17:04:37
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

一样的啊~不就是为了比较control和处理的某个基因的mRNA水平差异吗
比如预想中control高于处理
那么用control的摸,摸到刚好有条带或者稍微亮一点的循环数,就确定下来了
处理组可能这个循环还扩不出来(最理想,有和无的区别就不需要所谓的统计学)
或者条带很淡之类的

35个循环,也太多了
4楼2009-02-17 18:08:55
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yorkham

铜虫 (小有名气)

好,谢谢三磷酸腺苷,十分感谢
5楼2009-02-17 20:27:05
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