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求助，PCR纯化产物分光光度计与电泳结果不符 已有2人参与
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本人实验新人一枚，现在做的是PCR后内切来验证基因多态性，最近遇到了一个难以解决的问题。 本人现在现在用的是天跟的PCR MIX，然后用的是omega的纯化试剂，现在遇到的问题是：我纯化后的PCR产物（只有244bp），在酶标仪、分光光度计检测下浓度相差不大，都是50ul的PCR体系中可以提取出体积35ul，浓度约50-60ng/UL的，纯度1.8-2.0之间纯化液，但是电泳看不到除了MARKER之外的条带（图一），即使我加DNA总量达到了几百ng，仍然是什么都看不见，但是似乎隐约有点条带，联系OMEGA的技术后考虑其实并没有回收那么多的DNA，建议我加用异丙醇，但是我加了几百ng都看不见，我觉得加用异丙醇意义不是特别大，而且我是要做内切酶的，对DNA是有要求的（1ug），如果他们的试剂真的存在干扰浓度测定的话，接下来内切我也不好做，所以来求助一下各位大神，是否实验还有所改进，还是更换一些能更好提取小分子DNA的试剂。 PS：我做了引物浓度（华大基因）、模板DNA浓度、Tm的梯度，发现我的模板DNA需要加到几百ng，引物浓度需要加到1.6uM，才能得到比较清晰的条带，但是引物二聚体（40bp）在琼脂糖上一直很明显（图二，目的条带看起来不明显的原因是手机没拍好），PCR的纯化产物也应该是目的条带，因为我在不同引物浓度下的PCR，引物二聚体的条带亮度差别较大，但是纯化产物在酶标仪、分光光度计检测下浓度相差不大，所以应该是产物浓度。现在也是一筹莫展，恳请各位大神指点。 我之前好像也在丁香园看到过说是部分试剂存在这种情况，不知道各位大神有何指点。  图一1.jpg  图二.jpg |
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3楼2017-09-19 16:49:03
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-29 07:50:01
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胶回收试剂盒可能过期了，还有个原因是pcr产量本身就不多，没有条带只能重新扩增了，换个回收试剂盒，回收钱跑一两微电泳看一下条带大小 发自小木虫Android客户端 |
2楼2017-09-19 12:53:04
4楼2017-09-20 15:41:36
yubeihong
铁杆木虫 (职业作家)
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5楼2017-09-28 18:46:32
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