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2017mwl

新虫 (小有名气)

[交流] 酶切 已有2人参与

双酶切质粒 分别做了单酶切对照 电泳显示两个单酶切都是一条带 双酶切也是 连接转化涂板 空载体对照长得菌落比重组载体还多 菌落pcr全为假阳性 咋回事啊？

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1楼 2017-09-09 18:05:42
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15381380205

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到这种状况，原因一直没找出来

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2楼2017-09-10 15:22:38
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
质粒上两个酶之间有多大序列，这两个酶是不是同尾酶。或者两个酶是不是离的太近不能同时切。

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3楼2017-09-10 20:45:36
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2017mwl

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2017-09-10 20:45:36
质粒上两个酶之间有多大序列，这两个酶是不是同尾酶。或者两个酶是不是离的太近不能同时切。

相差十几bp 左右

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4楼2017-09-10 22:17:54
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2017mwl

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2017-09-10 20:45:36
质粒上两个酶之间有多大序列，这两个酶是不是同尾酶。或者两个酶是不是离的太近不能同时切。

不是同尾酶

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5楼2017-09-10 22:18:17
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2017mwl

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2017-09-10 20:45:36
质粒上两个酶之间有多大序列，这两个酶是不是同尾酶。或者两个酶是不是离的太近不能同时切。

Evor1和Xho1

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6楼2017-09-10 22:20:59
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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6楼: Originally posted by 2017mwl at 2017-09-10 22:20:59
Evor1和Xho1
...

Evor1我不知道，有没有可能这个酶切位点需要的保护碱基比较多，你需要顺序酶切。目的片段是扩增产物还是酶切产物，如果是扩增产物是否给酶切留了足够的保护碱基。无论是质粒还是片段都可以回收以后再进行连接。

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7楼2017-09-11 15:34:56
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2017mwl

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2017-09-11 15:34:56
Evor1我不知道，有没有可能这个酶切位点需要的保护碱基比较多，你需要顺序酶切。目的片段是扩增产物还是酶切产物，如果是扩增产物是否给酶切留了足够的保护碱基。无论是质粒还是片段都可以回收以后再进行连接。
...

Ecor1保护碱基一般一到三个 我用的三个

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8楼2017-09-11 16:27:43
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 2017mwl at 2017-09-11 16:27:43
Ecor1保护碱基一般一到三个 我用的三个
...

目的片段是否是扩增产物，是否进行了这两个酶的酶切，是否设计了保护碱基。

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9楼2017-09-11 21:25:37
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