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好学的虫虫!

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒转化rosetta后长出来呈糊状一层菌,不是单菌落,怎么回事?在线等。

我用质粒转rosetta,30分钟冰上,1分30秒金属浴,3分钟冰上,加300ul kan培养基,摇50分钟,涂kan平板,37度培养12小时后长出来一层模糊的菌。开学后rosetta重新制作,kan重新配,平板重新配,和之前的结果一样样的,怀疑质粒有问题,用之前做成功的质粒转化,发现长板的情况也是一层模糊的菌不是单菌落。是不是kan失效了?因为重新配的这两次kan用的是同一个小瓶中的,保质期到2020年,师妹用这个kan的液体培养基养菌提蛋白,跑胶是目的条带,但是我还是怀疑这个kan有问题,想问问大家有没有出现过这种情况?

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好学的虫虫!

新虫 (初入文坛)

大家帮忙看看,我已经在换kan了,如果是它的原因的话,会第一时间上传结果。

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2楼2017-09-07 10:40:25
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199006287956

木虫 (著名写手)

之前遇到这个事情,是因为质粒的问题,我是无意中用了同尾酶,导致自怜,菌长的多还糊

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追求不惜,奋斗不息
3楼2017-09-07 11:00:51
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

其实也不是很懂,帮你查了下。rosetta的感受态应该自带的是氯霉素吧,是不是应该涂CM板,而不是KAN板。当然也有可能是你转的质粒上带kan,这样的情况,可以试试涂无抗板,以及用无抗LB培养一会,通常低于12小时,然后再转入kan平板,说不定就好了,有可能是表达效率低下导致的菌落形态改变。我猜是这样,当然也不见得对,因为没做过rosetta,希望能帮到你。
4楼2017-09-07 16:51:26
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

其实我的意思就是先无抗,让它先长起来,然后再涂板,类似增菌过程
5楼2017-09-07 16:52:47
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好学的虫虫!

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-09-07 16:52:47
其实我的意思就是先无抗,让它先长起来,然后再涂板,类似增菌过程

嗯嗯,谢谢您!

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6楼2017-09-07 19:42:10
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好学的虫虫!

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-09-07 16:51:26
其实也不是很懂,帮你查了下。rosetta的感受态应该自带的是氯霉素吧,是不是应该涂CM板,而不是KAN板。当然也有可能是你转的质粒上带kan,这样的情况,可以试试涂无抗板,以及用无抗LB培养一会,通常低于12小时,然 ...

对,我的质粒是kan抗性的,它现在是感觉在疯长,不是不长,我也发现我这两次配好的kan并不是那么澄清,应该是kan的问题

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7楼2017-09-07 19:45:28
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好学的虫虫!

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 199006287956 at 2017-09-07 11:00:51
之前遇到这个事情,是因为质粒的问题,我是无意中用了同尾酶,导致自怜,菌长的多还糊

谢谢您,同尾酶是什么?这种酶得专门买吧,可能没有碰到这个酶,不过您后来能知道问题出现在这里确实不容易!

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8楼2017-09-07 19:53:05
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好学的虫虫!

新虫 (初入文坛)

今天结果出来了,我昨天借了别人家的kan,配固体培养基和液体培养基,重新转化后今天出来单克隆了,我也用未转化进质粒的rosetta在新旧两个kan的板上各涂10ul做对照,发现旧的板上能长出来模糊一片的菌,新的没有长点,没有菌,更加证明了旧板用的kan已经失效了。看来这个kan虽然在保质期内,但是说失效就失效以后还是得注意了!谢谢大家这两天对我的帮助!祝大家实验天天有结果,心情天天倍爽!

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9楼2017-09-08 08:18:32
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 好学的虫虫! at 2017-09-07 19:45:28
对,我的质粒是kan抗性的,它现在是感觉在疯长,不是不长,我也发现我这两次配好的kan并不是那么澄清,应该是kan的问题
...

也有可能,我昨天表述错误了,应该是表达量过高,不是表达量低导致菌落弥散状
10楼2017-09-08 08:31:37
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