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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 剪切掉目的基因后重组empty vector
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aishida

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hdhgls
11楼2017-09-06 18:39:07
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aishida

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hdhgls
12楼2017-09-06 18:42:55
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hdhgls

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12楼: Originally posted by aishida at 2017-09-06 18:42:55
你可以用他的方法试试呗，行的话就不用麻烦了
...

谢谢。有问题再请教。

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13楼2017-09-06 20:59:37
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aishida

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14楼2017-09-06 21:54:46
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hdhgls

金虫 (正式写手)
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14楼: Originally posted by aishida at 2017-09-06 21:54:46
不好意思，前面说错了。早晨的时候把taq酶当成t4了所以才说t4不行，后来反应过来了t4具有核酸外切酶活性，可以用于补平末端
...

好的，我用T4先试试，因为实验室T4的聚合酶和连接酶都有。谢谢。
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15楼2017-09-07 06:02:22
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hdhgls

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11楼: Originally posted by aishida at 2017-09-06 18:39:07
用高保真酶的目的产生是平末端的连接，高保真酶具有外切酶活性能把末端切平，T4具有末端转移酶活性，会在平末端3'端加碱基A，可能会连不上
...

再请教一下，我得到了几个colonies,但是不确定这是剪掉目的基因的，还是非特异的污染产生的，可以通过什么方法确定是empty vector, 它还可被同样的那两个限制酶剪切吗？谢谢

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16楼2017-09-10 20:17:50
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aishida

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17楼2017-09-10 22:19:10
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hdhgls

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17楼: Originally posted by aishida at 2017-09-10 22:19:10
一般是不能再被那两个酶酶切的。你可以选择那个载体中的一个酶切位点，最好不要用前面的两个酶切位点（看质粒图谱上的MCS）把质粒切开，观察条带大小就行了
...

估计那些个colonies是不知怎么污染导致的 因为在选择培养基中没有生长。我估计需要再连接一次试试

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18楼2017-09-11 00:08:25
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hdhgls
19楼2017-09-11 14:12:54
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19楼: Originally posted by aishida at 2017-09-11 14:12:54
还有一种方法，拿你的载体的通用引物来pcr，根据条带大小来判断是否是空载体
...

第一个方法可能好些，我没有这个载体的引物，而且闭合载体的条带大小不一定是其真实大小。我现在考虑的是怎么做empty载体，因为目的基因是从sal1和hind111切点嵌入的，我上次还是从这两个位点剪切，不知道对吗，或许应该从其他两个位点。

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20楼2017-09-11 16:18:05
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