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dulei木虫 (小有名气)
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[交流]
为什么Not 1 切不开？？？
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我从大肠杆菌DH5a中提出质粒，用Not 1酶切（质粒上有这个酶切位点），怎么切都切不开，请大虾们分析一下我什么地方可能出错了。 序列特征如下： ……— Kpn I — TTTAAA — Not I — …… — Xba I — Not I — …… 序列为： ……GGTACCTTTAAAGCGGCCGC……TCTAGA GCGGCCGC…… 我想要第一个Not I和Xba I 之间的序列（也就是中间的省略号处，大约1300bp），而Xba I后边有个Not I，如果直接用Xba I和Not I双酶切，后边的Not I会影响Xba I的活性，所以，我先用Xba I单酶切，然后纯化酶切产物（电泳验证，和原来未切的质粒比较，条带正确，说明Xba I切开了），然后再用Not I 切，怎么切都切不开，电泳还是只有Xba I单酶切的那条条带。 我用Not I酶切体系： 10H buffer 1ul BSA 1ul tritionX-100 1ul 水 4.5ul 质粒 2ul Not I 0.5ul Not I限制性内切酶是宝生物的。 网上说Not I效率不高，也有人切不开过，不过都没有给出合理的解释。望高手给个解释。 |
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