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嗜酸乳杆菌基因敲除的问题
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我现在将构建好的携带氯霉素抗性基因的敲除载体PNZ5319-luxS电转化导入噬酸菌后，在含氯霉素抗性的MRS平板中有菌落长出，就进行了提全基因组后PCR验证，p上游同源臂和下游同源臂。 我的问题是??1.现在状态的菌长的很慢，长3，4天也不会很浓，所以提出的全基因组条带也不是很亮? ?2.进行PCR，P出了在上下游位置的条带，但是都不亮，所以无法送去测序，而且pcr结果都很不稳定，很多时候P不出来。但是因为之前有P到，感觉这个基因是已经敲掉的，所以我不想放弃，因为之前电转化也做了好几个月，才有菌长出来的。我做这个实验还是小白，所以请各位帮帮忙分析一下，不胜感激！ 发自小木虫Android客户端 |
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zbd1990
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一般情况添加抗生素主要是为了防止质粒丢失，所以理论上对已经有抗性的菌株不加抗生素并不会影响基因组DNA的提取。 发自小木虫Android客户端 |
皮皮彤5楼2017-08-25 17:27:24
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2楼2017-08-25 08:36:02
3楼2017-08-25 10:24:25
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菌对氯霉素的耐受性普遍都不是很好，我以前做的大概添加浓度只有1-2.5微克每毫升，建议你做一个不加氯霉素的当对照，看看是不是氯霉素浓度过高引起的菌生长不好。 发自小木虫Android客户端 |
4楼2017-08-25 17:25:05