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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 多次跨膜、大分子量蛋白western求助！
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九罭之鱼

新虫 (小有名气)

[交流] 多次跨膜、大分子量蛋白western求助！ 已有5人参与

最近做了两个蛋白，western一直检不到，快哭了，求支招!!

两个蛋白都是70多kD，一个七次跨膜一个十二次跨膜，CMV启动，3HA标签的质粒在293T细胞中转染
之前同样的表达质粒表达细胞做过好几个其它蛋白，分子量偏小的膜蛋白一直没有问题，几秒钟就能曝光得很好
细胞用NP-40裂解液裂解后加loading buffer煮样

多次跨膜蛋白western有没有什么要注意的？是否会影响转膜？

求大神支招！！
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1楼 2017-08-21 22:50:00
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xmu_qpg

铜虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-24 07:44:42
大分子？70多KD？这个分子量不算大的，如果是多跨膜蛋白，建议loading 后，不要煮样，37度一个小时，离心后直接上样。煮样很容易使膜蛋白沉降！

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2楼2017-08-22 06:33:31
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chaosyw

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以用抗体的目录号上www.labome.com查下sci中的报道情况，可以借鉴别人的实验条件
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3楼2017-08-22 07:23:55
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九罭之鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xmu_qpg at 2017-08-22 06:33:31
大分子？70多KD？这个分子量不算大的，如果是多跨膜蛋白，建议loading 后，不要煮样，37度一个小时，离心后直接上样。煮样很容易使膜蛋白沉降！

细胞样品不煮一下非常黏，吸不上来，没法上样，有什么好办法？
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4楼2017-08-22 14:32:43
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xmu_qpg

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 九罭之鱼 at 2017-08-22 14:32:43
细胞样品不煮一下非常黏，吸不上来，没法上样，有什么好办法？...

超声啊 ，小功率多超几次就好了，一定冰山操作。
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5楼2017-08-22 22:10:57
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
I had the similar problem before, and we used 37-42 degrees to denature the membrane protein for 30-60 min
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jiayoubashaonian
6楼2017-08-24 06:15:46
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Andrea90

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主 问一下 我现在纯化一个7次跨膜蛋白 CMV启动子 HEK293表达 ，表达量很低 有什么好的方法提高表达量吗

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2017-12-26 11:37:29
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搬砖小兽

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by 九罭之鱼 at 2017-08-21 22:50:00
最近做了两个蛋白，western一直检不到，快哭了，求支招!!

两个蛋白都是70多kD，一个七次跨膜一个十二次跨膜，CMV启动，3HA标签的质粒在293T细胞中转染
之前同样的表达质粒表达细胞做过好几个其它蛋白，分子量偏 ...

想问楼主是怎样解决的？

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8楼2021-05-21 18:25:16
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搬砖小兽

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Andrea90 at 2017-12-26 11:37:29
楼主 问一下 我现在纯化一个7次跨膜蛋白 CMV启动子 HEK293表达 ，表达量很低 有什么好的方法提高表达量吗

请问前辈您的问题已经解决了吗？最近遇见四次跨膜，蛋白不知道有没有表达，估计表达量很低，曝光全是杂带。

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9楼2021-05-21 18:26:29
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