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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCRp不出来？！！！ 已有9人参与

最近在做构建质粒的实验。我是以cDNA为模板p全长为1kb的基因，用连接产物转化DH5a，板上长的单克隆并不多，且菌落比较小，挑单克隆摇菌后进行菌液PCR，之后鉴定没有出现条带，阳性对照也没有条带，请问这种情况会是什么原因呢？载体已经去磷了，引物也没有错。希望知道的朋友能给解答一下，感激不尽！
PCR体系如下：
                                      10ul
                 菌液                2
               10Xbuffer        1
                 taq                0.2
                 dNTPs           0.75
                 F                    0.25
                 R                   0.25
                 ddH2O         5.55
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1楼 2017-08-21 20:38:19
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ghst110

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:19:58
不知道楼主是什么抗性的质粒。如果感觉单菌落生长不正常，可能就不是你想要的转化子；
菌液PCR是比较好P出来的。但是10ul体系加2ul菌液实在太多了（原则上任何模板体积不应超过反应体系1/10），因为Reaction Buffer反应缓冲有限，而且菌液内存在抑制物可能会干扰实验结果。
建议：1，扩大PCR体系（20ul,最好50ul),降低菌液量（0.5-1）
          2,换一家更好性能的聚合酶产品试试。
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*才随遇长，识以穷精*
6楼2017-08-22 11:05:12
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:20:25
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度，PCR不work证明你的体系有问题，建议通过阳性对照找到问题原因，比如换一下其他的酶试试
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2楼2017-08-22 07:35:44
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
临溪蜚蜚: 金币+2, ★有帮助 2017-08-22 11:20:35
菌液最好不要超过0.5UL，里面的杂质会抑制PCR.但你2UL没P出来，也可能没连上。
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2017-08-22 07:55:58
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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxfd at 2017-08-22 07:35:44
用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度，PCR不work证明你的体系有问题，建议通过阳性对照找到问题原因，比如换一下其他的酶试试

“用提出的质粒鉴定是否阳性跟具有可信度” 请问这句话怎么理解，我没有提质粒，通过阳性对照找问题该怎么做呢？
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4楼2017-08-22 09:01:33
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