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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 上下游引物退火温度相差太大，退火温度梯度应该如何设置？
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qhiv6

新虫 (小有名气)

[交流] 上下游引物退火温度相差太大，退火温度梯度应该如何设置？ 已有6人参与

原来设计的引物时候没太注意，今天拿出来要做了才发现，上下游引物Tm值相差8℃，一个50一个58，请问摸退火温度的梯度应该如何设置？

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1楼 2017-08-14 21:04:02
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极北小白熊

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
从55往下，2度一个剃度

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3楼2017-08-14 21:17:51
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
经验是这个不影响，一般看产物的TM，引物只要GC值在许可范围即可。实在不行，做温度梯度PCR，看下结果
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4楼2017-08-15 08:37:04
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by qhiv6 at 2017-08-15 16:13:54
做了，不行，都没有条带，49-59每2度一个
...

那就是引物降解了，是不是用纯水溶的啊，最好用TE，避免反复冻融。如果这个引物一开始是可以做的话，那么可以考虑降解
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7楼2017-08-16 08:39:44
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学长阿亮

铁虫 (初入文坛)
你可以换一下酶，我用过一些酶它们对退火温度要求没那么严格，我有时候上下游引物差十多度一样可以跑出，根本不需要梯度
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9楼2017-08-16 20:54:01
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
取平均值上下也行

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
2楼2017-08-14 21:17:42
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qhiv6

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-08-15 08:37:04
经验是这个不影响，一般看产物的TM，引物只要GC值在许可范围即可。实在不行，做温度梯度PCR，看下结果

做了，不行，都没有条带，49-59每2度一个

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5楼2017-08-15 16:13:54
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艾喵喵

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你可以一度一个梯度试试

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6楼2017-08-15 17:52:25
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qhiv6

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-08-16 08:39:44
那就是引物降解了，是不是用纯水溶的啊，最好用TE，避免反复冻融。如果这个引物一开始是可以做的话，那么可以考虑降解...

第一次使用，好的，谢谢！！

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8楼2017-08-16 20:44:17
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qhiv6

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 学长阿亮 at 2017-08-16 20:54:01
你可以换一下酶，我用过一些酶它们对退火温度要求没那么严格，我有时候上下游引物差十多度一样可以跑出，根本不需要梯度

那你退火温度怎么设置的？

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10楼2017-08-17 08:28:14
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