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qhiv6

新虫 (小有名气)

[交流] 上下游引物退火温度相差太大,退火温度梯度应该如何设置?已有6人参与

原来设计的引物时候没太注意,今天拿出来要做了才发现,上下游引物Tm值相差8℃,一个50一个58,请问摸退火温度的梯度应该如何设置?

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极北小白熊

铁虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
从55往下,2度一个剃度

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3楼2017-08-14 21:17:51
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
经验是这个不影响,一般看产物的TM,引物只要GC值在许可范围即可。实在不行,做温度梯度PCR,看下结果
4楼2017-08-15 08:37:04
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by qhiv6 at 2017-08-15 16:13:54
做了,不行,都没有条带,49-59每2度一个
...

那就是引物降解了,是不是用纯水溶的啊,最好用TE,避免反复冻融。如果这个引物一开始是可以做的话,那么可以考虑降解
7楼2017-08-16 08:39:44
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学长阿亮

铁虫 (初入文坛)

你可以换一下酶,我用过一些酶它们对退火温度要求没那么严格,我有时候上下游引物差十多度一样可以跑出,根本不需要梯度
9楼2017-08-16 20:54:01
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普通回帖

sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
取平均值上下也行

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知识就像蒲公英的花儿一样,播种在世界的每一个角落。
2楼2017-08-14 21:17:42
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qhiv6

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-08-15 08:37:04
经验是这个不影响,一般看产物的TM,引物只要GC值在许可范围即可。实在不行,做温度梯度PCR,看下结果

做了,不行,都没有条带,49-59每2度一个

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5楼2017-08-15 16:13:54
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艾喵喵

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你可以一度一个梯度试试

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6楼2017-08-15 17:52:25
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qhiv6

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-08-16 08:39:44
那就是引物降解了,是不是用纯水溶的啊,最好用TE,避免反复冻融。如果这个引物一开始是可以做的话,那么可以考虑降解...

第一次使用,好的,谢谢!!

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8楼2017-08-16 20:44:17
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qhiv6

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 学长阿亮 at 2017-08-16 20:54:01
你可以换一下酶,我用过一些酶它们对退火温度要求没那么严格,我有时候上下游引物差十多度一样可以跑出,根本不需要梯度

那你退火温度怎么设置的?

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10楼2017-08-17 08:28:14
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