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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 农林 » 植保 » 对基因片段测序结果表示不解，求大神指导
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米夏girl

铜虫 (小有名气)

[求助] 对基因片段测序结果表示不解，求大神指导 已有1人参与

我对炭疽属真菌的CHS（编号D）、TUB2（编号E）、CAL（编号F）三个基因片段分别进行了PCR扩增，并送公司测序。但是对测序结果表示很不理解，问题如图中标注： http://\"对基因片段测序结果表示不解，求大神指导\" http://\"对基因片段测序结果表示不解，求大神指导-1\"
问题说明
【1】图1中，样品D3、D5、D7、D11在胶图中显示为清晰的单一条带，但测序结果全部为“正向双峰”，请问造成这种结果的原因会有哪些？胶图显示为单一条带，但是测序结果为“正向双峰”，但是反向正常，这种现象是什么原因呢？
【2】图2中样品E4、E2、E6、E10、E11在胶图中显示为清晰的单一条带，但测序结果全部为“反向双峰”，但正向是正常的。请问这是什么原因呢？

样品E9、E5、E7、E8条带清晰，但是结果为“双峰无条带，无法回收”，样品F2、F5也有清晰条带，测序结果为“信号弱\无信号”，请问造成上述结果的原因是什么呢？
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1楼 2017-08-14 16:54:54
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
米夏girl: 金币+10, ★★★很有帮助 2017-08-14 20:45:27
可能情况1：
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
解决办法：
用反向引物测互补链。
可能情况2：
质粒测序在插入序列中出现套峰
解决办法：
可能是样品非单克隆，挑其他测序。
可能情况3：
PCR产物测序中，某一点后序列变乱
解决办法：
可能是存在移码突变，这是正常的，也可以后测序。
可能情况4：
PCR产物中一个或多个位置有套峰
解决办法：
序列中存在突变，这是正常的，也可以后进行测序。
可能情况5：
PCR产物测序前部分双峰
解决办法：
引物二聚体污染或产物不纯，后测序。
可能情况6：
质粒和PCR产物测序出现双峰
解决办法：
引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。

如图中标注，没有看到你的图啊！
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及时行乐，人生不留遗憾！
2楼2017-08-14 19:29:59
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晋鹏

版主 (知名作家)
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9楼: Originally posted by 米夏girl at 2017-08-14 21:24:10
所以我自己切胶，然后再送测序的话，是不是结果会好点？...

最好的结果应当是：

1、更换一个技术更好的公司，能够保证PCR产物测通~（于你而言，省时省力）

2、PCR产物跑胶后（你的结果就很好），购买切胶回收试剂盒，自己切胶回收，转化大肠杆菌，菌液测序~（最可靠）
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10楼2017-08-14 21:31:33
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晋鹏

版主 (知名作家)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 米夏girl at 2017-08-14 21:45:46
有同学说800bp以下的基因片段，只要单向测通就可以用，没有必要双向测通并且得到拼接序列，请问这种说法是正确的么？...

单向测序:如果你的片段800bp以内，单向测序就OK了。
测通：单向测序800bp以内的也叫测通。
800bp以上的片段一般都是双向测序，速度快。
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12楼2017-08-14 21:49:00
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晋鹏

版主 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 米夏girl at 2017-08-14 21:14:28
是PCR产物直接送出去测的。切胶回收和测序都由公司做的。...

我就有点纳闷，产物图跑得这么漂亮，不至于结果这么不乐观的。

既然PCR产物直接送出去测的，那就比较正常了，这个测序结果与切胶回收关系很大。
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8楼2017-08-14 21:18:31
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米夏girl

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-14 19:29:59
可能情况1：
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
解决办法：
用反向引物测互补链。
可能情况2：
质粒测序在插入序列中出现套峰
解决办法：
可能是样品非单克隆，挑其他测序。
可能情况3：
PCR产物测序 ...

谢谢您！
回答的好详细，拿出小本本做笔记受教了！
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3楼2017-08-14 20:32:24
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米夏girl

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-14 19:29:59
可能情况1：
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
解决办法：
用反向引物测互补链。
可能情况2：
质粒测序在插入序列中出现套峰
解决办法：
可能是样品非单克隆，挑其他测序。
可能情况3：
PCR产物测序 ...

不好意思，这个帖子可能因为网络的问题，图片显示不出来了。我重新发了一个帖子，这是帖子的链接http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=11592511&target=1
里面补充了图片。谢谢您。
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4楼2017-08-14 20:45:06
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晋鹏

版主 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 米夏girl at 2017-08-14 20:45:06
不好意思，这个帖子可能因为网络的问题，图片显示不出来了。我重新发了一个帖子，这是帖子的链接http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=11592511&target=1
里面补充了图片。谢谢您。...

PCR产物 直接送出去测的吗？还是菌液PCR呢
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5楼2017-08-14 20:57:09
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塞北先生
晋鹏: 屏蔽内容, 不鼓励回复与帖子无关的内容~ 2017-08-18 20:29:57
本帖内容被屏蔽
6楼2017-08-14 21:06:23
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米夏girl

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-14 20:57:09
PCR产物 直接送出去测的吗？还是菌液PCR呢...

是PCR产物直接送出去测的。切胶回收和测序都由公司做的。
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7楼2017-08-14 21:14:28
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米夏girl

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-08-14 21:18:31
我就有点纳闷，产物图跑得这么漂亮，不至于结果这么不乐观的。

既然PCR产物直接送出去测的，那就比较正常了，这个测序结果与切胶回收关系很大。...

所以我自己切胶，然后再送测序的话，是不是结果会好点？
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9楼2017-08-14 21:24:10
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