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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求各位前辈帮忙分析一下：PCR产物电泳，出现弥散状和双条带是什么原因
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dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求各位前辈帮忙分析一下：PCR产物电泳，出现弥散状和双条带是什么原因 已有1人参与

样品1，2，3都是PCR产物。为什么样品1出现弥散状条带，样品3出现双条带。

求各位前辈帮忙分析一下：PCR产物电泳，出现弥散状和双条带是什么原因
2017.8.8   marker问题照片.png
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1楼 2017-08-09 10:13:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jie_1994

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-11 07:46:27
弥撒可能是样品模板两多了或者循环数多了，有时候酶量过多也会导致调带弥撒；双带可能是引物的非特异性扩增

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2楼2017-08-09 11:05:42
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dpsdxa212: 金币+20, ★★★很有帮助 2017-08-10 23:10:25
如果有目的条带，退火问题在一定范围内都会有目的条带出现，退火温度不同无非就是杂带亮点或弱点，我觉得可能是引物或模板有问题，引物的问题可能性比较大。。。。
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4楼2017-08-09 13:38:56
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jie_1994

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-11 07:46:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by dpsdxa212 at 2017-08-09 11:26:21
多谢多谢，弥散的问题我回去试试。那个双带的问题，请问应该如何解决呢。3个月前，我用这个引物扩PCR是单条带。于是我重新合成的相同的引物去扩，却出现双带。出现双带的引物Tm值 分别为52和51，我尝试了退火温度4 ...

其实你的退火温度比较低，可以尝试提高退火温度看看能不能减少非特异性扩展，平时我们扩展退火温度一般设置为60°左右的

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6楼2017-08-10 15:39:42
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dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jie_1994 at 2017-08-09 11:05:42
弥撒可能是样品模板两多了或者循环数多了，有时候酶量过多也会导致调带弥撒；双带可能是引物的非特异性扩增

多谢多谢，弥散的问题我回去试试。那个双带的问题，请问应该如何解决呢。3个月前，我用这个引物扩PCR是单条带。于是我重新合成的相同的引物去扩，却出现双带。出现双带的引物Tm值 分别为52和51，我尝试了退火温度43，46，51，53，55，58，循环次数为33。全部都有双条带。
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3楼2017-08-09 11:26:21
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jie_1994

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-11 07:46:38
你可以先在blast上看看你的引物是否容易发生特异性克隆，如果是建议重新更换引物，如果不是，有可能是模板不纯，需要重新制备模板，或者你的引物保存不当导致引物降解了，这样的情况还是重新合成引物吧

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5楼2017-08-10 14:34:07
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eric-amy

金虫 (小有名气)
提高退火温度试试，引物设计的不大合适

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7楼2017-08-10 16:36:41
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dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by eric-amy at 2017-08-10 16:36:41
提高退火温度试试，引物设计的不大合适

恩恩，目前已重新设计引物
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8楼2017-08-10 23:03:07
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dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jie_1994 at 2017-08-10 15:39:42
其实你的退火温度比较低，可以尝试提高退火温度看看能不能减少非特异性扩展，平时我们扩展退火温度一般设置为60°左右的
...

我有一个疑惑，就是  如果退火温度大于Tm值（比如高个5度），会导致没有任何条带吗？一般来说，PCR设定的退火温度应该要比Tm值低5度左右吧
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9楼2017-08-10 23:08:29
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dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cry_2013 at 2017-08-09 13:38:56
如果有目的条带，退火问题在一定范围内都会有目的条带出现，退火温度不同无非就是杂带亮点或弱点，我觉得可能是引物或模板有问题，引物的问题可能性比较大。。。。

多谢指点。的确，我调整了梯度退火温度，确实都是类似结果，原本没有条带的，无论怎么调都一样。现在已经重新设计引物
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10楼2017-08-10 23:12:43
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