| 查看: 5565 | 回复: 12 | ||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
电转影响因素及原理已有3人参与
|
||
|
影响电转的因素及如何影响的，已经电转了很多次还是没有克隆长出来，想了解下一些影响因素及原理，然后好去继续实验 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有174人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
【原创】非变性凝胶电泳原理及应用实例
已经有48人回复
9楼2017-08-02 11:57:40
晋鹏
版主 (知名作家)
- MolEPI: 6
- 应助: 626 (博士)
- 贵宾: 0.096
- 金币: 27590.2
- 散金: 1052
- 红花: 288
- 沙发: 2
- 帖子: 5663
- 在线: 726.4小时
- 虫号: 1183978
- 注册: 2011-01-05
- 性别: GG
- 专业: 生物信息学
- 管辖: 农林
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+6, MolEPI+1, 鼓励回帖交流 2017-08-02 07:45:31
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+6, MolEPI+1, 鼓励回帖交流 2017-08-02 07:45:31
|
电转原理： 电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/礸 DNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态‘，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/礸 DNA。 影响因素： ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。 此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、质粒dna的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。 对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。 ⑶、试剂的质量 所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。 ⑷、防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 ⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。 |
2楼2017-08-01 22:38:46
3楼2017-08-01 23:23:46
上一条不小心发出去了 一楼CaCl2都出来了 这是电转 哪来的CaCl2啊 讲道理电转的效率一般情况下很高 楼主最好把感受态制备和电转流程写一下 这样便于别人找问题在哪里哦 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2017-08-01 23:26:32