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youngsun50

木虫 (正式写手)

[求助] 用质粒做real-time PCR标准曲线，效果差。求助！ 已有2人参与

各位虫友，我用real-time PCR做Albumin的标准曲线，是用克隆了albumin序列的重组质粒做逐级10倍稀释（10^6 到10^0拷贝）。之前做过好多次，效果都很好，定量范围（即两个10倍稀释点之间的△Ct：2.6~4.0；复孔的△Ct<1.5）能够到10个拷贝。我3月1日做还是可以的，到3月15日再做，就开始变差了，这两次的条件包括质粒和试剂都没变。最近多次做的效果都能差，一些10倍稀释点之间的△Ct都>4.0，有时候有的点的复孔△Ct也>1.5。
我尝试过消除可能的原因，包括把引物和探针都新合成，质粒重新克隆并提取，换其他牌子的PCR mastermix， 结果都没有改善。
请给予建议或分析可能的原因，谢谢！
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学会感恩，强大自我
1楼 2017-07-26 14:30:56
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
youngsun50: 金币+2, ★有帮助 2017-07-26 18:08:22
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2017-08-30 07:44:53
1、一般情况，三个点都太少，一般还是要5个可以统计分析的点，而且最少也要做2个重复，否则，你的结果很有可能是一种偶然现象，一般R值要达到0.98才行。

2、进行相对定量不做标准曲线,不计算扩增效率而直接应用DeltaDelt CT法是不科学的!想必楼主是想用DeltaDelt CT法了,这个方法应用的前提是目的基因与内参基因扩增效率一致,试问你如果不做标准曲线又如何知道目的基因和内参基因的扩增效率?也就更谈不上要扩增效率一致了.

3、制作标准曲线,楼主可直接将样品稀释成一定的浓度梯度,直接进行扩增,最后一定要保证有5个浓度可以进行统计分析,而且至少重复一次.如果结果理想,目的基因和内参基因的扩增效率一致,那你就可以直接应用DeltaDelt CT法了,对另外几个处理进行定量的时候就没有必要再做标准曲线了.

4、一般说来,目的基因和内参基因的扩增效率相差3个百分点都可以认为效率是一致的!
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及时行乐，人生不留遗憾！
2楼2017-07-26 16:34:37
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-07-26 16:34:37
1、一般情况，三个点都太少，一般还是要5个可以统计分析的点，而且最少也要做2个重复，否则，你的结果很有可能是一种偶然现象，一般R值要达到0.98才行。

2、进行相对定量不做标准曲线,不计算扩增效率而直接应用D ...

谢谢这位童鞋!
不过一些地方你误会我了 逐条回复你的评论
1. 我的10^6 到 10^0， 已经7个点，且duplicate。
2. 我做的不是△△Ct法， 我是绝对定量，用质粒做标准曲线来定量我的样本（gDNA）。
3. 4. 我学习了， 谢谢

我遇到的问题，你有什么高见？
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学会感恩，强大自我
3楼2017-07-26 17:14:44
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drnvfe48
4楼2017-08-17 22:08:33
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芥末绿菲菲

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

首先复孔间CV的问题，这个只能是最后加样的问题，最后加样的时候建议还是小心一点还是可以避免复孔间CV的问题；
其次是10倍稀释点之间的△Ct，我是想问你稀释质粒的稀释液是什么，或许可以尝试用TE Buffer作稀释液配一条标曲试试看，我之前做质粒是可以用TE作稀释液配出来的标曲很好，所以你可以尝试一下，这只是我的建议，希望能对你有帮助
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5楼2017-08-29 21:16:15
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