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yippee_jiang

新虫 (小有名气)

[求助] 反转录用于qPCR的cDNA模板能否用于普通PCR扩增1-2k的序列? 已有2人参与

trizol法提了两次总RNA,但是有的基因扩增出来的片段比预测的序列多100+bp,有的基因多300+bp,不知道是预测的不准还是由于基因组DNA污染的问题,所以想用之前制备的qPCR模板试一下,因为这些模板制作的时候都用了去除基因组的试剂盒,但是听说qPCR模板允许扩增的片段较小,不能扩增较长片段序列,请哪位老师解释一下,谢谢!

BTW,我用本地BLAST在草鱼基因组中找到的目标序列,也就是我预测的序列,有没有可能是他基因组数据缺失一部分?
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日光海

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by yippee_jiang at 2017-07-26 17:11:07
问他们技术了,是个新手,说不清楚,只是强调他们用于qPCR的反转录试剂盒不能用于扩增跨一个内含子的基因,问为什么她也说不出来,就这个还是她去咨询了之后给我的回复...

应为cDNA是原始的DNA模板中取出内含子的部分。比如原始模板顺序:“A+内含子+B”,它的RNA反转除的cDNA是:“A+B”,所以用“A+B”的cDNA做模板扩增是得不到“A+内含子+B”的。
周老湿
10楼2017-11-03 13:10:57
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普通回帖

1993云崖

木虫 (小有名气)

暮雪千山,厚积薄发
2楼2017-07-24 22:35:16
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以扩增的。rt-qPCR的模板时总RNA逆转录的cDNA。
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
3楼2017-07-25 15:51:19
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yippee_jiang

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wangranjun at 2017-07-25 15:51:19
可以扩增的。rt-qPCR的模板时总RNA逆转录的cDNA。

但是,我用takara的for real time的反转录试剂盒做的cDNA模板在相同的条件下跑不出来,普通反转录的能跑出来
4楼2017-07-26 09:08:44
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

引用回帖:
4楼: Originally posted by yippee_jiang at 2017-07-26 09:08:44
但是,我用takara的for real time的反转录试剂盒做的cDNA模板在相同的条件下跑不出来,普通反转录的能跑出来...

我们实验室也一直在用takara的逆转录试剂盒,做克隆一般都没问题的。你用的那个试剂盒有什么特殊要求吗?
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
5楼2017-07-26 10:07:17
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yippee_jiang

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wangranjun at 2017-07-26 10:07:17
我们实验室也一直在用takara的逆转录试剂盒,做克隆一般都没问题的。你用的那个试剂盒有什么特殊要求吗?...

问他们技术了,是个新手,说不清楚,只是强调他们用于qPCR的反转录试剂盒不能用于扩增跨一个内含子的基因,问为什么她也说不出来,就这个还是她去咨询了之后给我的回复
6楼2017-07-26 17:11:07
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王查查23

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

7楼2017-07-26 17:50:05
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8楼2017-08-20 05:41:33
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out_of_sight

新虫 (小有名气)

楼主怎么找到的草鱼基因组?可以帮我找一个草鱼基因的序列吗?
9楼2017-08-26 10:12:34
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