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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒双酶切切不出来
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凡尘一瞬--亦随�

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒双酶切切不出来 已有1人参与

请问构建重组质粒过程中，双酶切检验一直切不出两条带，目的基因2000bp左右，载体是PB11210，内切酶是XmaⅠ和BamHⅠ的组合，还有XamⅠ和XbaⅠ的组合，求解！

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1楼 2017-07-10 14:13:25
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凡尘一瞬--亦随�

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-07-11 08:25:07
1、如果是TAKARA的应该是两内切酶是用同一buffer的 ，应该反应体系是合适的，故怀疑你是酶和buffer占的体积超过了反应体系的十分之一了 ，由于酶含有抑制酶活性的保存液，所以如果其占比例过大，会抑制其活性(详细请 ...

谢谢您，酶切体系是50微，buffer和酶都没有超，也考虑过甲基化的问题，请问去甲基化有什么好的解决办法吗？

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5楼2017-07-11 10:45:23
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
重新构

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
2楼2017-07-10 23:11:18
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、如果是TAKARA的应该是两内切酶是用同一buffer的 ，应该反应体系是合适的，故怀疑你是酶和buffer占的体积超过了反应体系的十分之一了 ，由于酶含有抑制酶活性的保存液，所以如果其占比例过大，会抑制其活性(详细请看该公司说明书). 建议加大反应体系的体积，另外由于酶的活性很大，如EcoR 1是2000 IU/ML,的一般1.5ul在标准反应体系中,1小时内足已切3ug的DNA了,所以不必过分加大酶量.

2、可能内切酶设置不够合理，存在甲基化等问题，不易切割，如不更换，建议重新设置引物构建重组载体。
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及时行乐，人生不留遗憾！
3楼2017-07-11 08:25:07
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凡尘一瞬--亦随�

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by MAS_rice at 2017-07-10 23:11:18
重新构

重复了很多遍了，一直是这个问题

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4楼2017-07-11 10:41:41
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