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关于Trizol法提取细菌总rna的问题
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新手用Trizol法提冶金微生物，Leptospirillum菌的总RNA，步骤如下： 1. 收集10ml菌液（含有黄铁矿，细菌吸附与黄铁矿上），10000rpm离心，去除上清，加入10ml含0.1%的Tween-20的培养基，漩涡震荡几分钟，2000rpm离心后，收集上清，上清再12000rpm离心收集菌体。 2. 将菌体收集至1.5ml EP管中，加入1 ml Trizol, 室温5min，充分溶解 3. 按比例200μl 氯仿/1ml Trizol，震荡混匀10-15 s， 室温放置2-3min 4. 4℃离心，12000rpm 15min，小心吸取上清透明液500μL，转移至新的Ep管 （离心后混合物分为三层：下层的红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层水样层，其容量为所加Trizol的60%，RNA全存在于水样层中） Note：吸取水样层时，切勿不要吸到中间层，里面溶有DNA；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相，存于4℃冰箱，中间层为蛋白质。 5. 加入等体积的异丙醇，约500μl，上下颠倒混匀，室温放置10min，使RNA析出沉淀。 6. 4℃离心，12000rpm 10min，弃上清，可见白色块状RNA沉于管底，小心弃上清 7. 加入1mL预冷的75%乙醇洗涤沉淀，温和震荡，沉淀悬浮即可 8. 4℃离心 8000rpm 5min，小心弃上清 9. 室温晾干或真空干燥2-5min，待乙醇挥发即可，不要过于干燥 10. 根据沉淀多少，溶于20-200μl DEPC水，用枪头吹打 55℃水浴5min 以溶解沉淀（-80℃可长期保存） 11. 测量浓度及OD值 用这样方法提了好几次RNA了，RNA的浓度都很低，都只有几十纳克每微升，而且260/280的比值也只有不到1.5。后面将菌液提高到50ml，结果也是这样。真是整个人都要奔溃了  ！后来买了天根的培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒用来提，这个结果更惨，RNA浓度最后只有不到10了。各位虫友，求救~~~~ |
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