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【交流】材料生物相容性检测心得分享（二 微核实验）
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微核实验是检验染色体损伤的一个简单的办法。本来是一种对辐射损伤程度的表征方法。把微核实验引入生物性容性检测可以表征植入材料对细胞产生的遗传毒性（genotoxicity），可以说比数数量和看形貌又深入一步。讨论材料表面氧化胁迫和离子释放是否会带来遗传毒性。不管染色体损伤还是染色体产生非整数倍都会让细胞周期停滞，启动修复程序，如果损伤恰恰在检测点（check point）则细胞会向肿瘤细胞分化，那就是相当危险的了。所以种在材料表面的细胞，我们不能仅仅关心它死不死，还要注意它是否会变异，这样微核实验可以帮我们这个忙。 需要的试剂除了细胞培养必须的试剂外还有 cytochalasin B from Dreschslera dematioidea(CB) 和Acridine orange hemi (zinc chloride) salt(AO)。另外需要荧光显微镜。 1 先把细胞中到你的材料上，注意要有阴性对照（种在petri dish上）长多少天一般根据选的细胞株和材料的具体性质有关。开始先做个预实验，看看几天比较合适，差异显著。 2 trpysin 细胞种到dish上，等细胞完全贴壁（3-4h），这时细胞周期已经开始，把原来medium吸走，换成含CB2.5ug/ml的meidum，培养两个doubling time 3 甲醇/醋酸9：1（v/v）固定20min，风干，0.01%AO PBS溶液染色4min，自来水洗掉。 4 荧光显微镜下面计数，1000个双核细胞中有多少个带微核的。 原理：细胞DNA损伤后在分裂时会形成微核与主核分离。CB的作用是使细胞质不分裂，细胞核分裂不受影响。所以双核细胞恰好是经历了一个周期的细胞。带微核的恰好是DNA受到损伤的细胞。 参考文献： Silicon-induced DNA damage pathway and its modulation by titanium plasma immersion ion implantation End-joining deficiency and radiosensitization induced by gemcitabine Molecular mechanisms of DNA double-strand break repair Cytokinesis-block micronucleus method in human-lymphocytes—effect of invivo aging and low-dose X-irradiation 基因VIII 如果做的时候有什么不明白的发帖咱们再讨论，呵呵 图中，绿色箭头为正常的双核细胞，红色箭头是微核的双核细胞啦 [ Last edited by yusen_1982 on 2009-2-13 at 20:11 ] |
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liubin(金币+1,VIP+0):你辛苦了！ 3-23 10:11
liubin(金币+1,VIP+0):你辛苦了！ 3-23 10:11
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AO如果买sigma的300块左右，够用一辈子，CB 500块吧，一套试验做下来也够了。呵呵。具体方法和货号参照Silicon Induced DNA Damage Pathway and Its Modulation by Titanium Plasma Immersion Ion Implantation, Biomaterials. vol. 29, no. 5, pp. 544 – 550 (2008) [ Last edited by dj04164 on 2009-3-4 at 23:52 ] |
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19楼2009-03-22 20:26:41
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