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连雨飘

银虫 (小有名气)

[求助] 求助gateway BP反应遇到的问题 已有1人参与

片段大小在1000bp 左右，入门载体用的是p-Donr207,做了差不多六七次BP反应了，每次都是长满板，摇菌也能摇起来，但菌液pcr没有条带。很明显是假的。问别人都说一般只长几个菌落，为什么我的每次都长满板子？是载体的问题?
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1楼 2017-06-06 09:38:34
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-08 07:48:00
你的BP反应体系是多少？分别加的DNA量呢？
pDONR207是庆大霉素抗性的，我们一般用的是LB+25mg/l 庆大的皿。你确定下你的抗生素是否失效了，需不需要重新配。因为1kb的片段BP是很好连的，但是也不会长满皿。

祝实验顺利
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
2楼2017-06-06 11:20:24
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by llearn at 2017-06-07 11:40:01
我也用的pDONR207，现在遇到问题是长的很少，都是假阳性，多长一会板子上有出现许多小菌落，菌落PCR也是假阳性，不知道为什么？请问你们是不是转化的DH5α，如果是，那它在庆大霉素的板子上一般多久长起来啊？
还 ...

我们用的也是DH5a呢，然后一般是过夜培养（大概16h）。蛋白酶K不加没问题，我们其实从来没加过。。。每次反应完直接就转化了
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
4楼2017-06-07 14:41:41
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伤何处

木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by llearn at 2017-06-07 22:14:16
我的片段有2.3KB。我也是这么想的，但是问题是交换完成了才不会有CCDB呀，菌落PCR又不对，所以我就觉得很奇怪，觉得CCDB是不是部分致死。...

那你的片段有点长...首先先确定下你的BP酶没有问题。然后2.3kb片段长度的，BP反应你需要加的DNA量要很大，接近200ng左右。这样才可能会有阳性菌落。
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
8楼2017-06-08 11:23:55
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伤何处

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by llearn at 2017-06-08 11:57:29
好的，谢谢你！
我把之前的酶都用完了，查了一下invitrogen官网想买新的都好贵好贵啊，请问你们买的是哪的啊，是不是都很贵啊老板说太贵了...

是很贵的....我们有时候不急着用的话 会和销售买那种做了免税的的，那个会便宜一些。
那你看能不能找其他实验室借一点咯
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10楼2017-06-08 13:32:10
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llearn

铜虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-20 23:08:25
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2楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-06 11:20:24
你的BP反应体系是多少？分别加的DNA量呢？
pDONR207是庆大霉素抗性的，我们一般用的是LB+25mg/l 庆大的皿。你确定下你的抗生素是否失效了，需不需要重新配。因为1kb的片段BP是很好连的，但是也不会长满皿。

祝实 ...

我也用的pDONR207，现在遇到问题是长的很少，都是假阳性，多长一会板子上有出现许多小菌落，菌落PCR也是假阳性，不知道为什么？请问你们是不是转化的DH5α，如果是，那它在庆大霉素的板子上一般多久长起来啊？
还有，我们protein K没有了，请问一下不用会不会有影响呢？
谢谢！
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3楼2017-06-07 11:40:01
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llearn

铜虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-07 14:41:41
我们用的也是DH5a呢，然后一般是过夜培养（大概16h）。蛋白酶K不加没问题，我们其实从来没加过。。。每次反应完直接就转化了...

哦哦。非常感谢！
另外想问一下你们做的阳性率高吗？５微升体系够了吧？我怀疑我们的酶失效了，因为放了好久了。
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5楼2017-06-07 17:06:17
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-08 07:48:14
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5楼: Originally posted by llearn at 2017-06-07 17:06:17
哦哦。非常感谢！
另外想问一下你们做的阳性率高吗？５微升体系够了吧？我怀疑我们的酶失效了，因为放了好久了。...

1kb以内基本都是阳性呢。我们用的3ul体系，你5微升肯定够了。现在的问题是，你转化后是长得满皿。如果酶失效了的话，那pDONR207转DH5a是不会有菌落的，因为有ccdB致死基因，除非你转的是DB3.1感受态。
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
6楼2017-06-07 21:45:45
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llearn

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-07 21:45:45
1kb以内基本都是阳性呢。我们用的3ul体系，你5微升肯定够了。现在的问题是，你转化后是长得满皿。如果酶失效了的话，那pDONR207转DH5a是不会有菌落的，因为有ccdB致死基因，除非你转的是DB3.1感受态。...

我的片段有2.3KB。我也是这么想的，但是问题是交换完成了才不会有CCDB呀，菌落PCR又不对，所以我就觉得很奇怪，觉得CCDB是不是部分致死。
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7楼2017-06-07 22:14:16
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llearn

铜虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-08 11:23:55
那你的片段有点长...首先先确定下你的BP酶没有问题。然后2.3kb片段长度的，BP反应你需要加的DNA量要很大，接近200ng左右。这样才可能会有阳性菌落。...

好的，谢谢你！
我把之前的酶都用完了，查了一下invitrogen官网想买新的都好贵好贵啊，请问你们买的是哪的啊，是不是都很贵啊老板说太贵了
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9楼2017-06-08 11:57:29
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