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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 带一段不与模板互补的长尾巴的引物如何确定退火温度？
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evasong

铜虫 (小有名气)

[交流] 带一段不与模板互补的长尾巴的引物如何确定退火温度？ 已有3人参与

我自己设计的一对引物，正引物长56bp，但是只有23bp是与模板DNA互补，剩下的33bp是一个长尾巴。请问用公式Tm = 2°C x (number of [A+T]) + 4°C x (number of [G+C])计算退火温度时，应不应该把尾巴序列算进去？

谢谢！
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1楼 2017-06-05 15:46:46
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xincer

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
决定DNA双螺旋稳定性的大部分是由于碱基堆砌作用，话句话说如果单链区不会形成二级结构，而且与杂交区无相互反应，那么不应该将其计算在内。但是实际上像你单链区已经达到了30bp以上，而不能忽略其对双链区稳定性的影响，所以严格来说，单纯的按照这个公式计算不太准确。推荐你IDT http://sg.idtdna.com/calc/analyzer，这里的算法比较好。
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evasong
2楼2017-06-06 16:17:43
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evasong

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xincer at 2017-06-06 16:17:43
决定DNA双螺旋稳定性的大部分是由于碱基堆砌作用，话句话说如果单链区不会形成二级结构，而且与杂交区无相互反应，那么不应该将其计算在内。但是实际上像你单链区已经达到了30bp以上，而不能忽略其对双链区稳定性的 ...

谢谢您！您推荐的网页很实用，请问有没有地方可以分别描述我这种特殊引物的单链区和双链区？
我查了一下我的引物，确实存在二级结构的问题，而且self-dimer和hetero-dimer都有，如果不想改变引物序列，请问有什么办法能加强双链区的稳定性？
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3楼2017-06-15 08:54:08
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xincer

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by evasong at 2017-06-15 08:54:08
谢谢您！您推荐的网页很实用，请问有没有地方可以分别描述我这种特殊引物的单链区和双链区？
我查了一下我的引物，确实存在二级结构的问题，而且self-dimer和hetero-dimer都有，如果不想改变引物序列，请问有什么 ...

你是跑pcr吗？

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4楼2017-06-15 11:23:33
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evasong

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xincer at 2017-06-15 11:23:33
你是跑pcr吗？
...

是的。因为要做二代测序，所以必须在5’端加一段挺长的额外序列。请问您有什么建议吗？
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5楼2017-06-16 10:14:30
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xincer

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by evasong at 2017-06-16 10:14:30
是的。因为要做二代测序，所以必须在5’端加一段挺长的额外序列。请问您有什么建议吗？...

你是测特定的已知片段吧。据我了解，不需要额外的序列呀。

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6楼2017-06-16 19:09:40
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evasong

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xincer at 2017-06-16 19:09:40
你是测特定的已知片段吧。据我了解，不需要额外的序列呀。
...

需要有一段通用序列用来做扩增barcode和接头的模板
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7楼2017-06-20 10:19:07
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楞楞爱吃糖

新虫 (初入文坛)
好难好难  有深度

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8楼2018-01-03 09:28:13
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dearwoniu

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
5端的不匹配序列，在计算Tm的时候不应该考虑到计算中的，也就是说，在评价引物时，只评价能够和模板匹配的序列。5端添加的接头序列和模板如果有不匹配，基本上不会产生结合。
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9楼2018-01-03 09:35:48
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