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如何纯化PCR产物做Infusion cloning 已有1人参与
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本人最近在做infusion cloning，有5个片段，1k-3k之间，用PHusion polymerase做PCR，可以扩增出单条的目的片段，共有100ul反应体积的产物，于是我用MB的GENEclean试剂盒直接对PCR产物进行提纯，得到的产物20ul。为了达到In fusion的要求，于是用nanodrop测浓度，看见吸收峰在245左右，与正常DNA形态差异较大，260/280为2.04。怕不纯，同样条件PCR，得到100ul体积的反应产物，跑胶后，用QIGEN的DNA extractions kit提DNA，得到30ul纯化产物，同样用nanodrop检测浓度，只有30ng/ul,且吸收峰在230，260/280为3.几，高的离奇。检索网上资料，说是有EDTA或者盐污染才会出现这种情况。于是多次重复，仍然得到类似结果。反复核实实验步骤无问题。本人也做过两年的分子试验，但从未测过PCR产物的纯度和浓度，但割胶提纯的DNA用于下游的克隆试验从来没有问题。这次做infusion克隆，因为protocol对片段和载体的浓度有要求，加上本人第一次做infusion克隆，怕DNA片段不纯，加上浓度没有预想中的高，不满足infusion的反应要求，不敢继续做下去。这样来回已经搞了两周了，没有一点进展。快崩溃了。不知坛子里的高人能否给些建议。多谢多谢。 发自小木虫IOS客户端 |
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